方案摘要
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检测样本 | 其他 |
检测项目 | |
参考标准 | 低聚糖,制备纯化 |
在本应用案例中,样品为极性很强的某合成低聚糖类分子,在普通C18反相柱上保留很弱,此外,其紫外吸收非常弱,不适合利用UV检测器对其进行检测。针对样品的具体性质,三泰科技的应用工程师利用SepaFlash HILIC ARG柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与外接ELSD检测器联用,成功对样品进行了纯化制备,获得了满足制备需求的目标产物,为极性很强的低聚糖类样品的纯化制备提供了一种可行的方案。
在本应用案例中,样品为极性很强的某合成低聚糖类分子,在普通C18反相柱上保留很弱,此外,其紫外吸收非常弱,不适合利用UV检测器对其进行检测。针对样品的具体性质,三泰科技的应用工程师利用SepaFlash HILIC ARG柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与外接ELSD检测器联用,成功对样品进行了纯化制备,获得了满足制备需求的目标产物,为极性很强的低聚糖类样品的纯化制备提供了一种可行的方案。
实验部分
本案例中待纯化的样品来自从事低聚糖应用研究的某大学实验室,为合成低聚糖类化合物,样品中含有聚合程度不同的其他副产物,极性很大,易溶于水,其分子结构式示意图参见图1。
图1. 低聚糖类样品分子结构式示意图。
由于样品分子极性很大,易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低,因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中,C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱,适合各类极性或非极性样品的分离,因此我们首先考虑利用一根C18反相分离柱尝试对样品进行分离纯化。取少量样品溶于水中,利用注射器上样至Flash分离柱上,样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。
表1. Flash制备纯化实验参数设置
仪器 | SepaBean machine T | |||
色谱柱 | 12 g SepaFlash C18反相分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号:SW-5222-012-SP) | 12 g SepaFlash HILIC ARG分离柱 (球形硅胶, 20 - 45 μm, 100 Å, 订货号:SW-5622-012-SP) | ||
检测波长 | 254 nm, 280 nm, ELSD | |||
流动相 | 溶剂A:水 溶剂B:乙腈 | |||
流速 | 30 mL/min | |||
进样量 | 30 mg | |||
洗脱梯度 | 时间 (CV) | 溶剂B (%) | 时间 (CV) | 溶剂B (%) |
0 | 10 | 0 | 95 | |
15.0 | 90 | 8.0 | 80 | |
/ | / | 15.0 | 80 | |
23.0 | 53 | |||
25.0 | 53 | |||
32.0 | 25 | |||
37.0 | 25 |
结果与讨论
样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知,由于样品极性较大,样品在普通C18反相柱上基本没有保留,随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来,未能获得有效的纯化。此外,从Flash制备图谱也可以看出,样品在紫外波段没有吸收信号,必须利用外接的ELSD检测器才能检测到样品的信号。
图2. 样品在C18反相柱上的Flash制备图谱。
基于普通C18反相柱对样品没有保留的实验结果,接下来我们考虑采用亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)模式对样品进行分离纯化。HILIC分离模式采用强亲水性的极性固定相,如三泰科技推出的SepaFlash HILIC ARG分离柱,其填料表面键合有极性很强的Arg基团(参见图3),可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。在HILIC分离模式下,流动相中水相比例在洗脱过程中逐步提高,因此适合于极性较大的样品的分离纯化。我们利用一根SepaFlash HILIC ARG分离柱对样品进行了分离纯化,Flash制备图谱如图4所示。分析图4可知,样品在HILIC ARG分离柱上获得了有效的保留,目标产物与副产物等杂质分离度良好。对收集组分进行TLC点板确认,采用浓硫酸/甲醇(V:V=1:5)作为显色剂,利用热风枪对TLC板烘烤15 min后,样品点的显色结果如图5所示,确认目标产物已经从副产物等杂质中有效地分离,可以应用于下一步研究开发中。
图3. SepaFlash HILIC ARG分离柱填料表面键合相示意图。
图4. 样品在HILIC ARG分离柱上的Flash制备图谱。
图5. 粗品及收集组分的TLC点板实验结果。
因此,对于极性很大且无紫外吸收的低聚糖类样品的纯化制备,SepaFlash HILIC ARG柱配合配置有ELSD检测器的快速液相制备色谱系统SepaBean machine,为此类样品的快速制备纯化提供了一种可行的方案。
关于SepaFlash HILIC ARG分离柱系列产品
三泰科技推出的SepaFlash HILIC ARG分离柱系列产品具有多种规格(参见表2)。
表2. SepaFlash HILIC ARG分离柱参数
(填料:High-efficiency spherical ARG, 20 – 45 μm, 100 Å)
Item Number | Column Size | Sample Size | Max.Pressure (psi/bar) |
SW-5622-004-SP | 5.4 g | 5.4 mg – 108 mg | 400/27.5 |
SW-5622-012-SP | 20 g | 20 mg – 0.40 g | 400/27.5 |
SW-5622-025-SP | 33 g | 33g – 0.66 g | 400/27.5 |
SW-5622-040-SP | 48 g | 48 mg – 0.96 g | 400/27.5 |
SW-5622-080-SP | 105 g | 105 mg – 2.1 g | 350/24.0 |
SW-5622-120-SP | 155 g | 155 mg – 3.1 g | 300/20.7 |
SW-5622-220-SP | 300 g | 300 mg – 6.0 g | 300/20.7 |
SW-5622-330-SP | 420 g | 420 mg – 8.4 g | 250/17.2 |
如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息,或配套使用的Flash纯化柱订购信息,请访问ChemBeanGo在线商店:https://store.chembeango.com/。
SepaFlash® Phenyl 色谱柱在苯二氮卓类药物化合物的分离纯化
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