方案摘要
方案下载| 应用领域 | 制药/生物制药 |
| 检测样本 | 原料药 |
| 检测项目 | 前处理>其他 |
| 参考标准 | 分离纯化 |
正相色谱和反相色谱是Flash制备色谱常用的两种分离模式，被广泛应用于各类有机合成产物的分离纯化中。在正相色谱中，采用极性固定相（如带有二醇基、氨基或氰基的固定相及硅胶、三氧化二铝等）并结合使用非极性流动相（如正己烷等），根据分子的极性大小将其分开。由于正相色谱以吸附效应作为分离的基础，因此也被称为吸附色谱。而在反相色谱中，采用非极性固定相（如带有C18基团的硅胶等）配合极性流动相对样品进行分离。这两种分离模式基于不同的分离机理，因此在将两种分离模式联用时可称之为正交色谱分离模式，从而获得对复杂样品更高的分辨力和更好的分离效果。本文中以某合成药物中间体为样品，利用SepaFlash系列正相硅胶柱及反相C18柱联合使用，实现了对样品的高效分离纯化，获得了满足纯度要求的目标产物，为此类复杂样品的快速制备纯化提供了新的思路。
实验部分
样品来自某新药研究公司，首先取微量样品溶于甲醇后进行HPLC纯度分析，参考如图1所示的粗品HPLC分析图谱，可知粗品纯度约为66%，其中有1个杂质成分其保留时间与目标产物非常接近，给后续的分离纯化提出了较高的要求。
图1. 粗品的HPLC分析图谱。
由于样品的极性较大，因此首先考虑采用普通正相硅胶柱对其进行分离纯化。取3 g样品溶于甲醇后，再以6 g硅胶（规格与Flash制备实验中所用硅胶柱填料相同）拌样，利用旋蒸仪除去溶剂后，固体上样至一根与Flash分离柱联用的iLOK®空柱中，Flash制备实验参数如表1所示。正相分离模式的Flash分离图谱如图2所示。
表1. 正相制备纯化实验参数设置。
仪器 | SepaBean® machine T |
色谱柱 | 80 g SepaFlash® Standard Series正相分离柱 |
(不定形硅胶, 40 - 63 μm, 60 Å, 订货号: S-5101-0080) | |
检测波长 | 220 nm；254 nm |
流动相 | 乙酸乙酯 |
流速 | 50 mL/min |
进样量 | 3 g粗品 |
洗脱梯度 | 100%等度洗脱 |
图2. 粗品在正相硅胶柱上的Flash制备图谱。
图3. 粗品经正相硅胶柱分离后收集组分的HPLC分析图谱。
取收集组分进行HPLC分析（如图3所示），结果表明：收集组分的纯度约为92%，与要求的95%以上纯度尚有一定差距。分析图3可知，与目标物具有近似保留时间的杂质未能与目标产物分离开。考虑到反相色谱模式与正相色谱模式的正交性，可以提供额外的分辨力，因此我们对正相分离的收集组分进行旋蒸处理去除溶剂后，取300 mg样品溶于2.5 mL甲醇中，并适当滴加DMSO使其完全溶解，然后采用液体进样的方式利用注射器上样至C18反相分离柱，Flash制备实验参数如表2所示。反相分离模式的Flash分离图谱如图4所示。
表2. 反相制备纯化实验参数设置。
仪器 | SepaBean® machine T | |
色谱柱 | 120g SepaFlash® Bonded Series C18反相分离柱 | |
(球型硅胶, 20 - 45 μm, 100Å, 订货号: SW-5222-120-SP) | ||
检测波长 | 220 nm；254 nm | |
流动相 | 溶剂A：水； | |
溶剂B：甲醇 | ||
流速 | 30 mL/min | |
进样量 | 2.5 mL (300 mg) | |
洗脱梯度 | 时间 (CV) | 溶剂B (%) |
0 | 60 | |
8 | 80 | |
12 | 80 | |
12.5 | 100 | |
13.5 | 100 | |
图4. 正相硅胶柱分离后收集组分在C18反相柱上的Flash制备图谱。
取收集组分进行HPLC分析，结果表明：收集组分的纯度约为98%，满足制备要求，可以用于客户的进一步研究和开发中。
结论
本案例表明，结合正相色谱与反相色谱，可以有效地提高Flash制备过程的分辨力，尤其适合于一些复杂样品的分离纯化，完成普通单一模式的正相色谱或反相色谱无法完成的制备任务。同时，与制备级HPLC相比，Flash制备色谱在色谱柱成本方面具有极大的优势，不失为广大研究人员经济高效的纯化解决方案。
关于SepaFlash® 正相硅胶柱和C18反相柱系列产品
三泰科技推出的SepaFlash® Standard Series正相硅胶柱和SepaFlash® Bonded Series C18反相柱系列产品具有多种规格（参见表3和表4）。
表3. SepaFlash® Standard Series正相分离柱参数
Item Number | Column Size | Sample Size | Flow Rate (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
S-5101-0004 | 4 g | 4 mg - 0.4 g | 15-40 | 300/20.7 |
S-5101-0012 | 12 g | 12 mg - 1.2 g | 30-60 | 300/20.7 |
S-5101-0025 | 25 g | 25 mg - 2.5 g | 30-60 | 300/20.7 |
S-5101-0040 | 40 g | 40 mg - 4.0 g | 40-70 | 300/20.7 |
S-5101-0080 | 80 g | 80 mg - 8.0 g | 50-100 | 200/13.8 |
S-5101-0120 | 120 g | 120 mg - 12 g | 60-150 | 200/13.8 |
S-5101-0220 | 220 g | 220 mg - 22 g | 80-220 | 150/10.3 |
S-5101-0330 | 330 g | 330 mg - 33 g | 80-220 | 150/10.3 |
S-5101-0800 | 800 g | 800 mg - 80 g | 100-300 | 100/6.9 |
S-5101-1600 | 1600 g | 1.6 g - 160 g | 200-500 | 100/6.9 |
S-5101-3000 | 3000 g | 3.0 g - 300 g | 200-500 | 100/6.9 |
文献贡献者
SepaFlash® Phenyl 色谱柱在苯二氮卓类药物化合物的分离纯化
应用于糖类化合物的分离纯化
应用于含硼有机光电材料领域分离纯化
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