方案摘要
方案下载应用领域 | 食品/农产品 |
检测样本 | 婴幼儿配方乳粉 |
检测项目 | 前处理>其他 |
参考标准 | 无 |
本研究探讨使用SepaBean machine快速液相制备色谱系统检测技术对糖类化合物进行制备纯化,结合UV检测器和ELSD检测器(蒸发光散射检测器)共同检测。选取葡萄糖、果糖、乳糖三种样品,由于样品为极性很强的糖类分子,在普通C18反相柱上保留很弱,针对样品的具体性质,应用工程师利用Sepa Flash氨基柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与ELSD检测器联用,成功对样品进行了纯化,为极性很强的糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。
SepaFlash氨基柱对糖类化合物的制备纯化研究
背景介绍
糖类化合物亦称碳水化合物,是多羟基(2个以上)的醛类或酮类化合物,在水解后能变成以上两者之一的有机化合物,在化学上由于其碳、氢、氧元素构成,在化学式的表现上类似于“碳”与“水”的聚合,故又称碳水化合物。糖类主要分为单糖、多糖、低聚糖。所有的糖都是以单糖为基本单位构成,从单糖开始,如葡萄糖和果糖,可以形成双糖、三糖或四糖,甚至有上亿个糖分子组成的复合聚合物--多糖。
糖类化合物是植物、动物和微生物的重要组分,与人类生活密切相关,是人体能量的主要来源。它不仅是营养物质,而且有些还具有特殊的生理活性。当其与脂质、肽、蛋白质甚至核酸结合时在医学上有相当大的应用,例如:人需要葡萄糖注射液、右旋糖酐作血浆制剂,肝脏中的肝素有抗凝血作用,血型中的糖与免疫活性有关。此外,核酸的组成成分中也含有糖类化合物--核糖和脱氧核糖。 糖类化合物在医学、营养学、免疫学等方面的应用日益受到越来越多研究人员的重视。
糖类化合物缺乏发色基团,导致其无紫外吸收或紫外吸收很弱,传统快速液相色谱法通常只配备紫外 (UV) 检测器,不能检测低含量或缺乏发色团的目标化合物。而低温蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种近乎通用的技术,具有紫外检测器不可比拟的优越性,任何挥发性低于流动相的样品均能被检测,此外ELSD的检测灵敏度也较高,可检测到更多微弱的信号。
本研究探讨使用SepaBean machine快速液相制备色谱系统检测技术对糖类化合物进行制备纯化,结合UV检测器和ELSD检测器(蒸发光散射检测器)共同检测。选取葡萄糖、果糖、乳糖三种样品,由于样品为极性很强的糖类分子,在普通C18反相柱上保留很弱,针对样品的具体性质,应用工程师利用Sepa Flash氨基柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与ELSD检测器联用,成功对样品进行了纯化,为极性很强的糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。
实验部分
样品信息:
葡萄糖:Glucose,C6H12O6,葡萄糖在生物学领域具有重要地位,是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物,即生物的主要供能物质。
果糖:Fructose,C6H12O6,广泛应用于食品、医药、保健品生产中。
乳糖:Lactose,C12H22O11,乳糖主要用于制造婴儿食品和配制药物,例如制药片、药粉时用作稀释剂。
以上样品极性很大,易溶于水,其分子结构式示意图参见图1。
图1. 糖类样品分子结构式示意图
由于样品分子极性很大,易溶于水而在有机溶剂中溶解度很低,因此正相分离模式首先被排除。在反相分离模式中,C18反相分离柱是常用的一种通用分离柱,适合各类极性较大样品的分离,因此我们首先尝试用一根C18反相分离柱对样品进行制备纯化。称取2g葡萄糖,2g果糖,4g乳糖样品溶于50ml水中,利用注射器取1ml混合样品上样至Flash分离柱上。相同的上样量条件下,我们也尝试用氨基柱进行实验,相较于C18反相分离柱,氨基分离柱适用于极性更大的样品纯化,样品的Flash制备纯化实验参数如表1所示。
表1. Flash制备纯化实验参数设置
仪器 | SepaBean machine T | |||
色谱柱 | 25g SepaFlash C18反相分离柱(超纯无定形C18硅胶, 40 - 63 μm,100 Å,订货号:SW-8201-025-IR) | 25 g SepaFlash氨基分离柱 (超纯无定形NH2键合硅胶, 40 - 63 μm,60 Å,订货号:SW-5501-025-IR) | ||
检测波长 | 254 nm,280 nm, ELSD | |||
流动相 | 溶剂A:水, 溶剂B:乙腈 | |||
流速 | 30 mL/min | |||
进样量 | 1ml | |||
洗脱梯度 | 时间 (Time) | 溶剂B (%) | 时间 (Time) | 溶剂B (%) |
0 | 95 | 0 | 95 | |
30 | 70 | 30 | 70 | |
40 | 70 | 40 | 70 | |
ELSD检测器参数设定 | ||||
ELSD流速 | 1ml/min | |||
增益值 | 0 | |||
ELSD温度 | 60℃ | |||
滤波常数 | 4s | |||
气压 | 2.2bar |
结果与讨论
样品在普通C18反相柱上的Flash制备图谱如图2所示。分析图2可知,由于样品极性较大,样品在普通C18反相柱上基本没有保留,随着流动相直接从分离柱上被洗脱下来,未能获得有效的纯化。此外,从Flash制备图谱也可以看出,样品在紫外波段没有吸收信号,必须利用外接的ELSD检测器才能检测样品
的信号。
图2. 样品在C18分离柱上的Flash制备纯化图谱
实验结果显示普通C18反相柱对物质保留较弱,这就是常用的反相模式的短板。众所周知,亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)采用强亲水性的极性固定相,适合于极性较大的样品的分离纯化。因此后考虑采用HILIC模式对样品进行制备纯化,如三泰科技推出的SepaFlash 氨基分离柱,其填料表面键合有极性很强的氨基基团(参见图3),可以对亲水性化合物样品产生足够的保留作用。
图3. SepaFlash氨基柱固定相键合基团示意图
HILIC色谱分离模式,与传统正相色谱相似,固定相比流动相具有更强的亲水性,极性物质倾向于与固定相作用,从而增加保留。然后逐渐增加流动相的极性而使样品依次洗脱。但其所用的溶剂又与反相色谱相似,采用与水互溶的极性有机溶剂 (一般为乙腈); 而不用传统正相色谱中所用溶剂(如正己烷、三氯甲烷) 。通常以高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相,其中有机部分是弱溶剂, 水溶液是强溶剂。水相比例在洗脱过程中逐步提高,因此适合于极性较大的样品的分离纯化。
利用SepaFlash氨基分离柱对样品制备纯化图谱如图4所示。样品在氨基分离柱上获得了有效的保留,三个样品分离度良好,成功对糖类化合物进行了制备纯化。
图4. 样品在氨基分离柱上的Flash制备纯化图谱
氨基柱的键合官能团氨丙基比反相色谱中常用的C18、C8等官能团更容易水解,因此当氨基柱在反相模式下使用时,其使用寿命会稍逊于普通的C18柱。需要特别注意控制所使用的流动相,流动相PH值越低或者含水比例越高造成氨基柱键合相水解的危险就越大。HILIC模式下,流动相选择时,首先确保流动相中至少含有3~5%的极性溶剂(如5%水,5%甲醇),以保证氨基柱中的硅胶始终处于被水浸润的状态;其次流动相体系中至少含有50%的有机相(一般情况下,有机相比例尽量不低于 70%)。氨基柱使用结束后,为保证其使用寿命,以95%乙腈/5%水作为氨基柱的保存溶剂。若需长期保存不用时,需将氨基柱用异丙醇保存起来。
SepaFlash 氨基柱订购信息
三泰科技推出的SepaFlash 氨基柱系列产品具有多种规格(参见表2)。
表2. SepaFlash 氨基柱参数
(Ultra-pure irregular NH2, 40 – 63 μm, 60 Å, amino content: 1.3 mmol/g, end-capped, surface area: 500m2/g, loading capacity: 0.1-2%)
Item Number | Column Size | Flow Rate (mL/min) | Max.Pressure (psi/bar) |
SW-5501-004-IR | 5.9 g | 10-20 | 400/27.5 |
SW-5501-012-IR | 23 g | 15-30 | 400/27.5 |
SW-5501-025-IR | 38 g | 15-30 | 400/27.5 |
SW-5501-040-IR | 55 g | 20-40 | 400/27.5 |
SW-5501-080-IR | 122 g | 30-60 | 350/24.0 |
SW-5501-120-IR | 180 g | 40-80 | 300/20.7 |
SW-5501-220-IR | 340 g | 50-100 | 300/20.7 |
SW-5501-330-IR | 475 g | 50-100 | 250/17.2 |
如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息,或配套使用的Flash纯化柱订购信息,请访问ChemBeanGo在线商店
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