湿法珠磨制备米诺地尔纳米颗粒实现高效靶向毛囊

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摘要：蛋黄米诺地尔，一款备受瞩目的生发神器，正以其独特的技术和成分，帮助越来越多的人重拾浓密秀发。Oaku团队致力于通过纳米技术，特别是通过珠磨法制备了5％MXD纳米颗粒制剂（MXD-NPs）。该配方既具有MXD纳米颗粒的分散性，又通过使用靶向毛囊的纳米颗粒来增强毛发生长效果，从而解决MXD治疗AGA中的疗效和安全性之间的平衡问题。

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米诺地尔，一款备受瞩目的生发神器，正以其独特的技术和成分，帮助越来越多的人重拾浓密秀发。这款产品以古代文明米诺斯王国的名字命名，寓意着恢复头发生长的神奇力量。

作为目前全球最畅销的生发药物，米诺地尔的出现却充斥着意外。在被发现这款药物针对脱发的强大疗效之前，它还仅仅是一款治疗高血压的临床药物。

不过，在上世纪70年代，医生们意外发现了米诺地尔的另类副作用：可让高血压患者重新长出毛发。这个意外发现，几乎一举扭转了人类治疗脱发无专用药物的尴尬局面。

米诺地尔（英语：Minoxidil）是一种钾通道开放药，这类药物在降压时常伴有反射性心动过速和心输出量的增加。对于血管扩张的作用具有选择性，见于冠状动脉，胃肠道血管和脑血管，而不扩张肾和皮肤血管。它还可以减低或停止掉发并且促进毛发再生。在实际应用中，米诺地尔是美国FDA公认的唯一有效治疗脱发的外用药物，在全球近百个国家都活跃着它的身影。^[1]

米诺地尔主要有酊剂、擦剂、喷雾剂和泡沫剂等剂型，临床中酊剂和擦剂更为常用。按照药物含量分类，又可以分为2%浓度和5%浓度两种，2%的剂型多用于女性和儿童，5%的剂型多用于男性，女性也同样可以使用。

截止2022年，中国脱发患病人数达到2.53亿人，预计2030年，中国的脱发人群数量将增长至2.58亿人左右。足见米诺地尔在中国的市场潜力巨大。^[2]

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然而，目前上市的米诺地尔也面临着一些挑战：在治疗雄激素性脱发（AGA）过程中，不同浓度的米诺地尔（MXD）对毛发生长效果的差异性研究不够充分、高浓度MXD可能带来的不良反应风险也尚未探明。

科研人员一直致力于克服这些问题。

Oaku团队专注于运用纳米技术，特别是通过珠磨法成功制备了含有5％MXD的纳米颗粒制剂（MXD-NPs）。这一制剂不仅继承了MXD纳米颗粒的良好分散性，还通过靶向毛囊的纳米颗粒，显著增强了毛发生长的效果，从而巧妙地平衡了MXD在治疗雄激素性脱发（AGA）中的疗效与安全性问题。

MXD配方的性能受到其平均粒径、溶解度、粘度和Zeta电位等参数的深刻影响。药物在制剂中的溶解状态有助于其渗透角质层，深入皮肤组织乃至血液循环。然而，纳米颗粒若尺寸过大，则难以通过角质层，从而限制了其渗透效果。值得欣喜的是，MXD纳米颗粒能够精准地靶向毛囊，因此在促进毛发生长方面，其效果远胜于传统的商业化MXD溶液。此外，纳米颗粒还显著提高了MXD在上部毛囊中的含量，并激活了毛囊干细胞，这一创新策略有望大幅提升MXD在治疗雄激素性脱发中的疗效和安全性。

因此，如何高效地制备出粒径适中、均一性好、分散性强且稳定性高的MXD纳米颗粒，成为了当前研究的重中之重。本文旨在简要介绍Oaku课题组在此方面的实验进展，以期为读者提供有关这一领域的最新动态。^[3]

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• MXD-NPs制备：

  将MXD粉末和MC（用于增强MXD纳米粒子的分散性并提高珠磨机的粉碎效率）混合，然后使用玛瑙研钵在4℃条件下研磨1.5小时，并将混合物（MXD 5g 和 MC 8g）悬浮在100 mL含有甲基p的纯化水中，使用羟基苯甲酸酯（0.026%）和对羟基苯甲酸丙酯（0.014%）作为防腐剂。将分散体装在有氧化锆珠（直径为0.1mm）的2mL管中搅拌。

  之后，通过超声波处理5分钟以及珠磨机研磨30秒。超声波和珠磨机处理在4℃下交替重复30次。

  此外，使用台式珠子粉碎机粉碎研磨分散体120分钟，并将获得的分散体用作MXD-NPs。

  
  

• MXD-MPs制备：

  具有相同成分的未研磨分散体（5%MXD、8%MC、0.026%对羟基苯甲酸甲酯和 0.014% 对羟基苯甲酸丙酯添加到纯水中）被定义为MXD-MPs（对照组），并且两种 MXD 制剂的pH值均调整至6.8。

1. MXD含量检测——液相色谱（HPLC）

2. 粒度检测——纳米粒度仪（DLS）、纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）、原子力显微镜(AFM)

3. Zeta电位检测——Zeta电位分析仪（ELS）

4. 生发效果评估

   4.1 数码相机拍摄——实验前2天剃除C57BL/6小鼠背部毛发，然后每天一次将MXD制剂重复应用于C57BL/6小鼠的· 4.2 背部区域，并每天使用数码相机拍摄毛发生长。

   4.3 毛囊中IGF-1和VEGF蛋白测试——酶标仪测定吸光度

   4.4 皮肤组织、毛发隆起、毛球和血液中的MXD含量测量——HPLC、蛋白质测定试剂盒。

   4.5 通过HE和免疫染色来评定毛发生长效果——显微镜。

实验采用珠磨法成功制备了含有5%MXD固体纳米粒子的分散体。为了提高MXD纳米粒子的分散性，并避免药物浓度上升导致制剂中分散颗粒的加速聚集，研究人员特别添加了高甲基纤维素（MC）。在本次试验中，选用了8%的MC含量来制备MXD-NPs，即含有5%MXD固体纳米粒子的悬浮液，从而有效防止了MXD固体纳米颗粒在制剂中的聚集。

同时，研究人员还测量了MXD配方的平均粒径、溶解度、粘度和zeta电位等关键参数（如下表1所示），以便更全面地了解和分析其性能。

表1.MXD-MPs 和 MXD-NPs平均粒径、溶解度、粘度和 zeta 电位对比

此外，制备的MXD纳米粒子分散体的稳定性也是重点评估指标。通过追踪14天外观的变化，以及测定体系中MXD含量来评估其稳定性，结果如下图1和图2所示。由结果可知，MXD-NPs具有更好的长期稳定性。

图1.MXD-MPs 和 MXD-NPs存放14天实物图

图2.MXD-MPs 和 MXD-NPs存放14天MXD含量变化曲线图

通过C57BL/6小鼠背部毛发实验，进一步评估不同样品生发效果。其结果见图3和图4。

       Vehicle            MXD-MPs        MXD-NPs          CA-MXD

图3.MXD制剂对C57BL/6小鼠重复处理(每天1次)的数码照片。从上至下依次为第1、8、10天记录照片；MXD制剂依次为：Vehicle（载体，仅使用用于制备MXD-MPs和MXD-NPs制剂的载体。）、MXD-MPs和MXD-NPs、CA-MXD（市售MXD溶液）

        Vehicle            MXD-MPs        MXD-NPs          CA-MXD

图4.反复应用MXD制剂(每天1次)8 d和10 d后C57BL/6小鼠皮肤横切面图像。从上至下依次为第8、10天记录照片；MXD制剂依次为：Vehicle（载体，仅使用用于制备MXD-MPs和MXD-NPs制剂的载体。）、MXD-MPs和MXD-NPs、CA-MXD（市售MXD溶液）

通过图3和图4结果可知，MXD-NPs配方比CA-MXD配方更早产生了头发生长。对于这一现象，进一步对毛囊传递途径进行了新的评估，将毛囊分为上部（毛囊隆起区）和下部（毛囊球）。可发现MXD-NPs处理的小鼠的毛囊隆起区中的MXD浓度高于CA-MXD处理的小鼠，而MXD-NPs处理的小鼠的毛囊球和皮肤组织中的MXD含量低于CA-MXD处理的小鼠（图5）。

另外，在MXD-NPs处理的小鼠的血液中没有检测到MXD（图5）。通常认为药物通过连续的角质层（SC）或通过附属物穿透皮肤。Nagai等人报道过平均直径约为200 nm的纳米颗粒通过角质层阻止了纳米颗粒的渗透。溶解在制剂中的药物被认为会渗透角质层并深入皮肤组织以及血液中。

在本实验中，MXD-NPs的粒径为70-200 nm，这些纳米颗粒可能难以通过角质层。MXD-NPs中固体MXD的比例超过99％，这意味着只有很少量的MXD能够渗透角质层。这可能解释了MXD-NPs处理的小鼠皮肤组织和血液中MXD含量较低的现象。另外，纳米颗粒可能通过毛囊孔道迁入毛囊，增强MXD治疗脱发的疗效，提高患者在疗效和安全性方面的满意度。

图5. 在MXD制剂应用后的4小时内，C57BL/6小鼠的皮肤组织（A），毛囊隆起区（B），毛囊球（C）和血液（D）中的MXD含量。n = 4-12。MXD-MPs，应用MXD-MPs的小鼠。MXD-NPs，应用MXD-NPs的小鼠。CA-MXD，应用CA-MXD的小鼠。N.D.，不可检测。* p < 0.05与每组MXD-MPs相比。＃p < 0.05与每组CA-MXD相比。

这些研究结果表明，与毛囊中的MXD含量相比，毛囊隆起区中的MXD含量可能与促进头发生长的效果更强相关。众所周知，隆起区的细胞具有干细胞特性，并能产生次级胚细胞，在生长期开始时产生新的毛干[38]。假设注入到毛囊隆起区的MXD激活了毛囊上皮干细胞。因此，进一步进行了免疫组织化学染色来评估表达CD200的干细胞的增殖和激活情况。结果显示，在接受MXD-NPs处理的小鼠中，CD200的表达观察到在隆起区和亚隆起区，而在接受CA-MXD处理的小鼠中，CD200只在毛囊隆起区的一个更有限的区域内观察到（图6）。

图6.MXD制剂对C57BL/6小鼠皮肤组织（毛囊隆起区和毛囊球）的显微效果，在重复使用开始后的8天（每天一次）。(A) C57BL/6小鼠皮肤组织标本的H&E染色图像（条状刻度表示100&micro;m）；(B) 图A中方框所示区域的高倍显微镜图像（条状刻度表表示50&micro;m）；(C)图A中显示的连续片段的CD200免疫染色的光学图像（条状刻度表表示100&micro;m）；(D)图C中方框所示区域的高倍显微镜图像（条状刻度表表示50&micro;m）。箭头表示CD200的表达。CD200染成棕色；与CA-MXD组相比，MXD-NPs组中的CD200表达增强。

综上所述，这些结果表明，MXD-NPs将高MXD含量传递到毛囊隆起区，可能导致毛囊上皮干细胞的增殖和激活，从而增强头发生长的效果（图7）。然而，目前对于MXD如何促进头发生长的理解还很有限，对于MXD与干细胞之间的直接相互作用也知之甚少。MXD纳米颗粒粒径，稳定性作用机制有待进一步研究。

图7.MXD-MPs（粉末型）、MXD-NPs（纳米颗粒型）和CA-MXD（溶液型）配方向毛囊隆起区和毛囊球区域输送药物的示意图。

Oaku团队成功开发了一种含有5%米诺地尔（MXD）的纳米颗粒制剂，用于增强小鼠的毛发生长。这项研究为我们展示了纳米技术在药物输送中的巨大潜力。

在实验中，MXD纳米颗粒表现出了显著的优势。与商业化MXD溶液相比，MXD纳米颗粒能够更高效地靶向毛囊，导致了更加显著的毛发生长。研究结果显示，MXD纳米颗粒使得MXD在上部毛囊中的含量显著增加，进而激活了毛囊干细胞，为雄激素性脱发的治疗提供了新的可能性。

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常见分散方法的球磨法或砂磨机，在分散时物料、磨珠与机体之间的撞击会对纳米晶、混悬剂中的纳米颗粒造成损伤，磨损的材料进入料液中会变成难以除去的杂质，这对料液的纯度产生不利的影响，此外，机械力过大时局部升温过快，也会导致物料的不稳定，影响后续的使用。

日本HM&M珠磨机的UAM机型采用立式珠磨设计，使得流经腔体的物料能获得充分的珠磨分散和破碎，获得更为均一体系。同时，UAM也是世界上首次采用离心分离方式分离磨珠的珠磨机。利用离心力将磨珠和浆液分离，因此不需要考虑浆液出口处的间隙大小，即使是使用微珠，也不会发生堵塞。UAM是第一台用于纳米分散的珠磨机，并用于商业生产，可适用于细至15μm的微珠，这是目前最小的磨珠。UAM不仅适用于微珠，还适用于1mm的较大磨珠，适用范围广，可应用于亚微米粒子的粉碎或纳米粒子的分散等多个领域。同时，设计简单，易于拆卸和组装。也容易回收残留在研磨腔体中的浆料。

• 可使用微小磨珠进行连续分散和粉碎处理离心式珠料分离器，能应对各种磨珠粒径

• 磨珠切换简单，操作便利

• 拆卸和组装操作便利，易于回收浆料

• 具有良好的清洁性，方便应对物料切换

图8. HM&M珠磨机

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PSI-20高压微射流均质机（小试兼中试型）采用固定结构的均质腔，通过电液传动的增压器使物料在高压作用下以极大的速度流经交互容腔的微管通道，物料流在此过程中受到高剪切力、高碰撞力、空穴效应等物理作用，使得平均粒径降低、体系均一稳定，由此获得理想的均质、分散、去团聚的结果。

• 最高2069 bar的均质压力，最高处理量20L/h （PSI-20）

• 采用特殊设计Y型腔，去除尾端大颗粒效果佳，物料的混合更均一，处理效率高。

• 屏显界面，数据可溯源：支持数据导出设定压力及实时压力、监测点温度、实时流量、时间等。

• 配置K型热电偶：可用于实施监测料液温度。

• 低噪音：运行音量低于70分贝，工作环境友好型。

图9.PSI-40 高压微射流均质机

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难溶性药物，如米诺地尔的粒径对其后续药用效果具有很大影响。溶解在制剂中的药物渗透角质层并深入皮肤组织以及血液中，而过大尺寸的纳米颗粒则难以透过角质层，进而阻止了纳米颗粒的渗透。MXD纳米颗粒可以高效地靶向毛囊，导致毛发生长比商业化MXD溶液更为显著。此外，纳米颗粒使得MXD在上部毛囊中的含量显著增加，并激活毛囊干细胞，因此，需要制备尺寸均一，分散性好的纳米颗粒用于有效的提高生发效果。

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

图10. Nicomp 3000系列（实验室）

• 粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

• 搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

• 高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然现实较好的分辨率和准确度。

图10.1∶高斯粒径分布图

图10.2∶Nicomp多峰粒径分布图

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而过大尺寸的纳米颗粒则难以透过角质层，进而阻止了纳米颗粒的渗透。MXD纳米颗粒可以高效地靶向毛囊，导致毛发生长比商业化MXD溶液更为显著。因此，对于大颗粒（尾端大粒子）的监控，对于筛选并优化米诺地尔配方，成品检测具有重要意义。

AccuSizer系列在检测液体中颗粒数量的同时精确检测颗粒的粒度及粒度分布，通过搭配不同传感器、进样器，适配不同的样本的测试需求，能快速而准确地测量颗粒粒径以及颗粒数量/浓度。

图11.  AccuSizer A7000系列

• 检测范围为0.5μm-400μm（可将下限拓展至0.15μm）。

• 0.01μm的超高分辨率，AccuSizer系列具有1024个数据通道，能反映复杂样品的细微差异，为研发及品控保驾护航。

• 灵敏度高达10PPT级别，即使只有微量的颗粒通过传感器，也可以精准检测出来。

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米诺地尔属于难溶性药物，其粒径在亚微米到微米级别，分散体系如果稳定性差，可较短时间内发生沉降分层。在实际使用过程中，稳定性的差异也会影响产品均一性，产品中纳米颗粒粒径的情况。而纳米颗粒的粒径大小会直接影响其生发效果，是否会渗透，是否会被角质层阻隔，是否在毛囊中积累等。因此，在米诺地尔配方选择及工艺优化阶段，稳定性的评估非常重要，通过快速评估稳定性，可在研发阶段对不同米诺地尔配方进行筛选，对工艺进行优化，大大缩短研发时间。

LumiFuge稳定性分析仪可以直接测量整个样品的分散体的稳定性，检测和区分各种不稳定现象，如上浮、絮凝、聚集、聚结、沉降等，通过测量结果可用来开发新的配方和优化现有的配方及工艺。

图12. LUM稳定性分析仪系列

• 快速、直接测试稳定性，无需稀释，温度范围宽广

• 可同时测8个样品，测量及辨别不同的不稳定现象及不稳定性指数

• 加速离心，最高等效2300倍重力加速度

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在米诺地尔制备过程中，过滤可有效去除米诺地尔中的尾端大颗粒和其他杂质，使得样品体系更为均一。过滤时使用不同的膜将会影响物理拦截，吸附拦截等效果，需根据不同的工艺选择能相容该产品的滤芯。

Entegris-Anow是一家高分子微孔膜过滤企业，专业从事MCE、Nylon、PES、PVDF、PTFE等（膜孔径为0.03μm~10μm）微孔膜的研发及生产，具有二十多年服务与医药客户经验，并为全球生物制药、医疗器械、食品饮料、实验室分析、微电子及工业等领域的客户提供过滤、分离和净化解决方案。

参考资料：

[1] A. K. Gupta, M. Talukder, M. Venkataraman, et al. Minoxidil: a comprehensive review[J]. Journal of Dermatological Treatment,2021, DOI:10.1080/09546634.2021.1945527]

[2] 中国米诺地尔行业发展深度分析与投资前景预测报告（2023-2030年）

[3] Oaku Y, Abe A, Sasano Y, Sasaki F, Kubota C, Yamamoto N, Nagahama T, Nagai N. Minoxidil Nanoparticles Targeting Hair Follicles Enhance Hair Growth in C57BL/6 Mice. Pharmaceutics. 2022 Apr 27;14(5):947. doi: 10.3390/pharmaceutics14050947. PMID: 35631533; PMCID: PMC9145891.

[4] Barry, B.W. Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery. Eur. J. Pharm. Sci. 2001, 14, 101–114.

[5] Nagai, N.; Ito, Y. Excessive hydrogen peroxide enhances the attachment of amyloid β1-42 in the lens epithelium of UPL rats, a hereditary model for cataracts. Toxicology 2014, 315, 55–64.

[6] Nagai, N.; Iwai, Y.; Sakamoto, A.; Otake, H.; Oaku, Y.; Abe, A.; Nagahama, T. Drug delivery system based on minoxidil nanoparticles promotes hair growth in C57BL/6 mice. Int. J. Nanomed. 2019, 14, 7921–7931.

[7] Garza, L.A.; Yang, C.C.; Zhao, T.; Blatt, H.B.; Lee, M.; He, H.; Stanton, D.C.; Carrasco, L.; Spiegel, J.H.; Tobias, J.W.; et al. Bald scalp in men with androgenetic alopecia retains hair follicle stem cells but lacks CD200-rich and CD34-positive hair follicle progenitor cells. J. Clin. Investig. 2011, 121, 613–622.