1.引言
质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外,另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前,已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
由于质粒分子小、便于分离和提取的特点,在DNA重组中,质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体,携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达,因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现,质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展,所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。因此,质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。
提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中,碱变性提取法最为经典和常用,是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的,适用于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单,易于操作,一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;质粒DNA的大部分氢键断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc(或NaAc)高盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通过酚/氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。
电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质,它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段,是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速,分辨率高,分辨范围极广。此外,凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到,甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。
溴化乙锭(EB)是一种具扁平分子的核酸染料,可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间,并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光,所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下,荧光的强度是同DNA片段的大小(或数量)成正比。
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