远慕技术:电泳后的凝胶染色实验

实验概要
本文介绍了电泳后主要的凝胶染色方法,包括:标准考马斯亮蓝染色法、快速考马斯亮蓝染色法、凝胶铵银染色法、凝胶中性银染色法及凝胶铜染色法。


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实验步骤
1. 标准考马斯亮蓝染色法
   1) 电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中);
   2) 室温下振摇温育4h至过夜;
   3) 去除染色液,收集保存可重复使用20-40次;
   4) 依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白/每条带。
注:使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热,(大约50-60℃),染色时间可缩短至20min,脱色时间约 1-2h。

2. 快速考马斯亮蓝染色法
   1) 电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%三氯yi酸中);
   2) 室温下振摇温育20min;
   3) 去除染色液,收集保存可重复使用多次;
   4) 加入数倍体积的脱色液(25%甲醇、7%乙酸)室温振摇下脱色。必要时可更换脱色液。灵敏度为1.0ug蛋白/每条带。

3. 凝胶铵银染色法
   1) 电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的50%乙醇和10%乙酸,振摇30min至过夜;
   2) 去除50%乙醇和10%乙酸,用去离子水清洗凝胶。加入20%乙醇, 室温振摇30min;
   3) 去除20%乙醇,再加5倍体积的20%乙醇,室温振摇30min;
   4) 去除20%乙醇,将凝胶转入通风柜内,加入5倍体积的用去离子水配制的5%戊二醛,室温振摇30min;
   5) 去除戊二醛,用去离子水清洗凝胶。加入5倍体积的20%乙醇,室温振摇20min;
   6) 去除20%乙醇,重复6两次;
   7) 去除20%乙醇,用去离子水清洗凝胶。再加入5倍体积的用去离子水,室温温育10min;
   8) 去除去离子水,加入4倍体积新鲜配制的氨水/银溶液,室温振摇30min。配制100ml:加1.4ml 14.8mol/L氢氧化铵到100ml水中,再加入190ul 10mol/L氢氧化钠;放置涡旋器上缓缓加入1ml新鲜配制的硝酸银溶液(0.8g硝酸银/ml水),直至出现沉淀物,但很快溶解。
   9) 去除氨水/银溶液,用去离子水清洗凝胶20min以上,其间更换水数次;
   10) 去除水,加入5倍体积新鲜配制的0.005%柠檬酸,0.019%的甲醛。轻柔混匀,数分钟内条带即显现出。当背景开始变化时,去除显影剂,用用去离子水清洗凝胶。在10%乙酸和20%乙醇中温育凝胶,以终止反应。灵敏度为1-10ng蛋白/每条带。
注:操作时,应戴手套并使用洁净的玻璃器皿,以免污染,影响反应的灵敏度。


4. 凝胶中性银染色法
   1) 电泳后,将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的30%乙醇和10%乙酸,振摇30min至过夜;
   2) 去除乙醇/乙酸溶液,加入5倍体积的30%乙醇, 室温振摇30min;
   3) 去除乙醇,再加5倍体积的30%乙醇,室温振摇30min;
   4) 去除乙醇,加入10倍体积的去离子水,室温振摇10min;重复用去离子水清洗两次;
   5) 去除去离子水,加入4倍体积新鲜配制的0.1%硝酸银溶液(用室温下贮存于棕色瓶内的20%原液稀释而得),室温振摇30min;
   6) 去除硝酸银溶液,用去离子水清洗凝胶20s;
   7) 去除水,加入5倍体积的2.5%碳酸钠和 0.02%的甲醛(pH<4.0),室温振摇温育,数分钟内条带即显现出。当背景开始变黑时,停止温育;
   8) 在1%乙酸内清洗,停止反映。用去离子水清洗,更换数次,每次10min; 灵敏度为1-10ng蛋白/每条带。


5. 凝胶铜染色法
凝胶铜染色法为考马斯亮蓝或银染色法的替代染色方法。将凝胶氯化铜溶液中温育,在Tris和SDS同时存在时可形成明显的白色不透明的沉淀物。蛋白条仍然清晰,留下一个多肽分离模式的附染图象。由于蛋白质未结合在凝胶上,可通过EDTA去除Cu离子而得以洗脱,因而该方法特别适合需快速定位蛋白条带用于免疫反应,或进一步进行蛋白质化学研究。其染色模式如同考马斯亮蓝或银染色法的凝胶,易进行拍照。


   1) 电泳后,凝胶用蒸馏水短时清洗数次,每次30s,勿洗过长时间;
   2) 将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.3mol/L CuCl2;
   3) 室温振摇5min,较厚的凝胶可适当延长时间。当CuCl2进入凝胶时,在不含蛋白的区域会出现白色沉淀;
   4) 用蒸馏水清洗数分钟,在黑色背景下观察结果。灵敏度为10-100ng蛋白/每条带(0.5mm厚的凝胶)或1ug蛋白/每条带(1mm厚的凝胶)。
注:将凝胶在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中温育可使铜染逆转。

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