WB 是检测和定量磷酸化蛋白质的重要实验方法,然而大家一直都说磷酸化蛋白 WB 不好做!WB 磷酸化蛋白曝不出条带的时候,会特别沮丧。
远慕在此给大家列出几点小建议,希望能帮助您改善一下实验结果。
1、样本是否表达:
查阅资料或通过预实验确定。
2、对照设置:
阳性和阴性对照。
总蛋白抗体对照,对于特定时间的特定样品,磷酸化和非磷酸化蛋白质的总和代表该特定蛋白质的总量。在相同的 WB 检测中, 磷酸化蛋白质的量增加通常伴随着非磷酸化蛋白质的降低。
3、内参设置:
根据实验选择合适的内参,如Actin、GAPDH 等
4、适当的提取方法:
蛋白质提取的方法不仅影响提取效率,还会影响蛋白的质量。建议采用裂解液裂解和超声破碎组合的方式,可确保整个样本充分裂解。
5、低温操作:
室温条件下,磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。请勿反复冻融,操作时一定置于冰上。
6、加入抑制剂:
组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶,它会导致磷酸化蛋白的去磷酸化,因此,必须在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂。
7、最重要的一点:
检测时选择近红外荧光标记抗体,一次可检测多个蛋白,无需多次曝片,方便检测。一般磷酸化和总蛋白的条带位置十分接近,传统方式不易区分。
这样大家在用WB检测磷酸化水平时,是不是就方便多了,不用像传统方法那样,在压完磷酸化抗体后,将膜 strip 后再压总蛋白抗体;也不需要同时跑两块胶分别检测。
使用近红外荧光标记抗体(二抗),孵育后直接放入仪器,一键成像,简单快速!
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