植物提取物常用检测方法介绍

含量测定的定量分析法大类上主要包括：色谱分析法,光谱分析法，定量分析法。

一、色谱分析法

色谱分析法是一种分离分析方法，系根据混合物中各组分的色谱行为差异，将组分从混合物中分离后再选择性对待测组分进行分析的方法。因此色谱分析法是分析混合物的最有力的手段。

1. 高效液相色谱法（HPLC）

 HPLC全称是High Performance Liquid Chromatography（高效液相色谱法），又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。HPLC检测方法，因对含有众多成分的复杂体系具有强大的分离功能，且分析速度快，其重现性和准确度优于薄层色谱法。是中药及其制剂含量测定的首选方法，中国药典大多采用 HPLC 进行含量测定。

 1.1 高效液相色谱分析的流程

由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

    1.2 高效液相色谱的分离过程

同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。

不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

1.3 高效液相色谱含量计算

一般分面积归一法，外标法，内标法，植物提取物用前两个比较多。

面积归一化法：假定样品中的所有组分全部流出而且检测器对它们都产生信号，计算各杂质峰面积以及总和。该方法操作简单，不用标准品，结果相对准确，但是校正因子确定繁琐和重复性不好。国内植物提取物厂家很多为用的是这种检测方法。

外标法：要用标准品，检测结果准确，但是受标准物质和线性范围影响。标准品分国产和进口的，有时客户会指定进口的标品，价格比较昂贵。

内标法： 色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。内标法是将一定重量的纯物质作为内标物(参见内标物条)加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)及相对校正因子，按公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量。检测结果很准确但是内标物选择困难。植物提取物一般不用。

2. 薄层色谱分析法（TLC）

薄层色谱分析法是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf)作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。

薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。

3. 气相色谱法（GC）

GC：Gas Chromatography 气相色谱法用气体作为移动相的色谱法。用气体为流动相流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法，一般用于测挥发物质的含量，比如农药残留 666，DDT 的检测用的就是这种方法。

根据所用固定相的不同可分为两类：固定相是固体的，称为气固色谱法；固定相是液体的则称为气液色谱法。

气相色谱系统由盛在管柱内的吸附剂，或惰性固体上涂着液体的固定相和不断通过管柱的气体的流动相组成。将欲分离、分析的样品从管柱一端加入后，由于固定相对样品中各组分吸附或溶解能力不同，即各组分在固定相和流动相之间的分配系数有差别，当组分在两相中反复多次进行分配并随移动相向前移动时，各组分沿管柱运动的速度就不同，分配系数小的组分被固定相滞留的时间短，能较快地从色谱柱末端流出。以各组分从柱末端流出的浓度 c对进样后的时间t作图，得到的图称为色谱图。

二、光谱分析法

当物质吸收辐射能或者热能后，其内部发生能级跃迁，记录由能级跃迁所产生的辐射能随波长的变化所得到的图谱成为光谱。利用物质光谱进行定性，定量和结构分析的方法称为光谱分析法。

1. 紫外吸收光谱分析法（UV）

UV检测法也是植物提取物常用的检测方法之一，UV全称紫外-可见分光光度法，是 Ultraviolet and visiblespectrophotometry 的缩写，是基于物质分子对紫外光区(波长200~400nm)和可见光区(波长为 400~760nm)的单色光辐射的吸收特性建立的色谱分析方法。UV检测也称紫外检测法、紫外光谱检测法。 UV检测法主要用于配合物组成及其稳定常数的测定。紫外光谱是分子中某些价电子吸收了一定波长的电磁波,由低能级跃近到高能级而产生的一种光谱，当分子中的电子吸收能量后会从基态跃迁到激发态，然后放出能量（辐射出特征谱线），回到基态；而辐射出特征普线的波长在紫外区中就叫做紫外光谱（UV）。

1.1 UV定性分析

在有机化合物的定性分析中，紫外－可见光谱适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。此外，可配合红外光谱、核磁共振波谱法和质谱法进行定性鉴定和结构分析，因此它仍不失为是一种有用的辅助方法。一般有两种定性分析方法，比较吸收光谱曲线和用经验规则计算最大吸收波长λmax，然后与实测值进行比较。 结构分析可用来确定化合物的构型和构象。如辨别顺反异构体和互变异构体。

1.2 UV定量分析

紫外－可见分光光度定量分析的依据是Lambert-Beer定律，即在一定波长处被测定物质的吸光度与它的溶度呈线性关系。应此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度可求出该物质在溶液中的浓度和含量。常用的测定方法有：单组分定量法、多组分定量法、双波长法、示差分光光度法和导数光谱法等。

1. 原子吸收光谱法（AAS）

原子吸收光谱法（AAS），全称是Atomic Absorption Spectrometry。是基于气态的基态原子外层电子对紫外光和可见光范围的相对应原子共振辐射线的吸收强度来定量被测元素含量为基础的分析方法，是一种测量特定气态原子对光辐射的吸收的方法。

AAS基本原理是，每一种元素的原子不仅可以发射一系列特征谱线，也可以吸收与发射线波长相同的特征谱线。当光源发射的某一特征波长的光通过原子蒸气时，即入射辐射的频率等于原子中的电子由基态跃迁到较高能态（一般情况下都是第一激发态）所需要的能量频率时，原子中的外层电子将选择性地吸收其同种元素所发射的特征谱线，使入射光减弱。

由于原子能级是量子化的，因此，在所有的情况下，原子对辐射的吸收都是有选择性的。由于各元素的原子结构和外层电子的排布不同，元素从基态跃迁至第一激发态时吸收的能量不同，因而各元素的共振吸收线具有不同的特征。原子吸收光谱位于光谱的紫外区和可见区。

三、定量分析法

定量分析法也称滴定法，是将已知浓度的滴定液(标准物质溶液)由滴定管滴加到被测溶液中，直至滴定液与被测物质反应完全(通过适当方法指示)，然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测物质的含量。

四：目前植物提取物常见五种检测方法的应用领域

检测方法	应用领域
高效液相色谱法（HPLC）	标准植物提取物的常用检测方法
薄层色谱分析法（TLC）	被用于比例提取物的检测
气相色谱法（GC）	用来检测挥发性液体或油类
紫外分光光度计（UV）	标准植物提取物的常用检测方法
原子吸收光谱法（AAS）	用于提取物重金属含量的检测