人巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)ELISA试剂盒实验步骤检测仪器_检测方案

方案详情

试剂盒使用目的：
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)含量。

人巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)ELISA试剂盒实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)水平。用纯化的人巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)，再与HRP标记的巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人巨噬细胞替代激活相关化学因子1(AmAC-1)浓度。

试剂盒组成：
Reagent   Quantity
酶标包被板   12well×8strips
标准品 960pg/ml   1×0.5ml
标准品稀释液   1×1.5ml
酶标试剂   1×6ml
样品稀释液   1×6ml
显色剂A液   1×6ml
显色剂B液   1×6ml
终止液   1×6ml
30倍浓缩洗涤液   1×20ml×30flod
说明书   1
封板膜   2
密封袋   1

样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000
转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保
存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：
1. 标准品：其浓度为960pg/ml(贮液)。先将其稀释为960pg/ml(标准曲线最高浓度)后，再准备5个稀释标准品的EP 管，每个EP 管中加入150μL 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成960pg/ml，480pg/ml，240pg/ml，120pg/ml，60pg/ml，30pg/ml，标准品稀释液（0ng/L)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液

Tube   0   1   2   3   4   5
pg/ml   960pg/ml   480pg/ml   240pg/ml   120pg/ml   60pg/ml   30pg/ml
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待
测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μ l，然后再加待测样品 10μ l（样品最终稀释度为 5 倍）   。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
4. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，
如此重复 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μ l，空白孔除外。
7. 温育：操作同 3。
8. 洗涤：操作同 5。
9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μ l，再加入显色剂 B50μ l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15 分钟.
10. 终止：每孔加终止液 50μ l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应
在加终止液后 15 分钟以内进行。

注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后
如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间
最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD
值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。

计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 以上。
2.批内与批见应分别小于 9%和 11%
3.保存条件及有效期：
a.试剂盒保存：2-8℃。
b.有效期：6 个月

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