影响原核表达的因素以及解决方法

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构建质粒载体时，要考虑质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码子，融合标签，复制子，筛选标记基因等因素。

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影响原核表达的因素


1、翻译起始位点
现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行了优化，一般情况下不需要自己再添加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子。

2、GC含量
表达序列中的GC含量超过70%的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。

3、mRNA二级结构
在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。


4、密码子的偏爱性

如果外源基因密码子的使用频率和宿主菌高效表达的基因密码子的使用频率差异较大，翻译时核糖体在稀有密码子处就会产生停顿，这不仅降低蛋白质的合成效率，导致新生肽链的错误折叠而影响延伸，甚至会停止翻译。


5、质粒载体的选择

构建质粒载体时，要考虑质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码子，融合标签，复制子，筛选标记基因等因素。


6、基因或者蛋白的大小

一般来说小于10kd和大于100kd的蛋白都是难以表达的。


7、外源基因对宿主有毒性

外源基因在宿主内会抑制宿主菌的生长甚至导致宿主死亡，表观的现象：宿主菌在诱导后菌体量上升缓慢或不在生长。


8、基因突变（移筐突变）

碱基的突变、插入或缺失对阅读框的影响，可能会导致表达的蛋白质结构改变，或蛋白质合成过早终止。


9、培养诱导条件

培养基成分（C/N）及培养条件（温度、诱导时机、诱导剂，浓度、诱导时间）也是影响蛋白表达的。


解决方法

1、 更换宿主菌
稀有密码子补给：BL21 Condon plus （DE3）、Rosetta是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA,CUA,CCC和GGA。它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。
毒性蛋白：包含pLysS质粒的宿主菌达到稳定期时溶菌酶表达水平较高，而目的蛋白表达水平降低，有效缓解蛋白对宿主带来的影响，也可降低蛋白的表达水平，缓解蛋白对宿主的毒性。


2、 转化菌株进行基因测序

确定基因序列的准确性，查看是否存在突变，截短等。


3、 全菌样品做Western blot


4、 摇TB，小试纯化（选择高温诱导）


5、 更换培养基尝试
有的在LB中不表达，换TB或2*YT则会表达

文献贡献者

上海远慕生物科技有限公司
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