方案摘要
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荧光定量pcr的溶解曲线理解:用Syber Green方法做完PCR后,用来判断产物是否相对专一。应结束后,逐渐加温。和Syber Green分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链,就不能在和SyberGreen结合。
荧光定量pcr的溶解曲线理解:用Syber Green方法做完PCR后,用来判断产物是否相对专一。应结束后,逐渐加温。和Syber Green分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链,就不能在和SyberGreen结合。
一般每加温一度,读一次信号。当温度到达PCR产物的Tm时,产物解离一下增多。曲线的横坐标是温度,而纵坐标是荧光信号的变化,开始加热,信号变化不大,所以几乎是平的。
接近Tm时,突然变化加大,所以出现峰值。再升温,产物全部解离,就又是一条直线了。如果有非特异性产物,在加热过程中就会出现一些比较矮,宽的峰。
荧光定量pcr较为理想的熔解曲线是单峰曲线,如出现多峰有以下原因:
1)非特异性扩增:
主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高,可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度 PCR 对引物退火温度(Tm值)进行优化,上调Tm值,选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂,提高核酸提取质量,等等。
2)引物二聚体 可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带,通常位于100 bp以下。引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右,如该峰显著请按照以下方面进行优化:
A.优化扩增条件,如提高退火温度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常两步循环(由 95℃变性步骤直接进入 60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增,因此引物设计时设定的成功退火温度为 60℃。
B.引物浓度太高,适当降低引物浓度。通常引物的Tm低于目的基因,熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。大多数情况下,每条引物的理想最终浓度为200 nM,但如有需要,可将浓度降至60nM。
C.cDNA模板带有基因组DNA污染:
重新制备cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理,然后逆转录为cDNA。
如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况,就要考虑及时更换试剂盒,避免耽误实验进度。
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