人神经生长因子前体(proNGF)elisa试剂盒

                                                                                      人神经生长因子前体(proNGF)elisa试剂盒
试验原理:

ELISA检测试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

试剂盒组成：

标本收集与试剂准备: 

1. 血清、血浆样本收集应使用一次性的无热原，无内毒素试管（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝均可），血清、血浆避免使用溶血，高血脂标本，标本悬浮物应离心去除，使标本清澈透明。待测样本应尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-80℃）保存，避免反复冻融。

2. 洗涤液配置：用蒸馏水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水）

3. 标准品配制：取7个1.5ml离心管，分别标注1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64，blank。从第壹至七管中分别加入标准品/样品稀释液200ul。在第壹管中加入标准品溶液200ul，置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第六管中吸出200ul弃去，第七管为空白对照。

4. 生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液，根据所需用量配置，当日使用，剩余弃之。

5. TMB显色液的配置：使用前10分钟，将TMB显色液A液和B液1：1混合，避光放置备用。

6. 如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最糕值，建议重新检测，请根据实际情况，适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数)

操作步骤：

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为72 pg/mL，48 pg/mL ，24pg/mL，12 pg/mL，6 pg/mL）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
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