在液相色谱中,峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响,从而影响分析结果的准确性。
01
峰后拖
图1: 常见的3种拖尾情况
次级保留引起的峰拖尾:
反相色谱中,通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形,而带有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾,原因是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生次级保留效应。
解决方案
先检查样品是否过载,由于样品过载引起的峰形后拖不能通过改变色谱条件消除。如果发现过载,需降低进样量(包括进样体积或浓度),进样量越小,峰形越好。
例如头孢尼西钠的测定:
2. 调节流动相pH
将流动相的pH调至比弱酸pKa小2以上,比弱碱pKa大2以上,可有效抑制易离子化待测物的电离,从而取得良好峰形。
例如二甲基苯氧乙酸的测定:
3.增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度
流动相中加入缓冲盐,增强了流动相的离子强度,在-NH3+等极性基团和硅羟基Si-O-之间存在着许多离子的干扰,减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会,有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用,改善峰形。
这种适合于碱性较弱(如氨基的N原子与强吸电子基相连),或碱性很强。但在刚性结构中,比较难以接近被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基。
例如高乌甲素的测定:
4)加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵或辛烷磺酸钠等
拖尾的产生是因为-NH2、-NHR、-NR2与硅羟基发生静电作用引起的,那么阻碍它们之间静电作用的途径,应该有两种,一种是占据硅羟基这个作用位点,另一种是占据-NH2、-NHR、-NR2这个作用位点。
在流动相中加入三乙胺,能显著的改善峰形,消除拖尾,其作用是屏蔽硅羟基。
加入三乙胺改善峰形的时候,有两点需要注意:
1)三乙胺的碱性很强,加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围,对色谱柱造成损伤。pH的改变也会导致出峰时间的显著变化,可能引起的其它问题,建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值。通常即使pH回调过后,由于三乙胺成为了固定相的一部分,保留时间也有较大变化;
2)三乙胺在210nm处有比较强的吸收,如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用。
流动相中加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂也能很好的改善峰形,其作用机理与三乙胺和四丁基硫酸氢铵颇为不同,是通过与样品分子的作用来阻止样品分子与硅羟基的作用来改善峰形。
02
峰前拖
峰前拖发生的概率比较小,下面是三种前拖峰的表现形式:
解决办法
造成前拖峰的原因有多种,我们可依次逐一排查:
样品是否过载
降低进样浓度,看峰形是否有所改善。一般认为峰高在100mAU左右比较合适,不至于因过载影响峰形。
检查是否是用流动相溶解样品
溶解样品的溶剂(如纯甲醇)洗脱能力比流动相强会发生峰前拖。
具体机理是:正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的,浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布。样品溶液进样后到达色谱柱时间很短,应还未被流动相充分稀释,洗脱能力更强的样品溶剂的局部存在,将使部分样品被洗脱的速度加快,导致峰前拖。
增加流动相中缓冲盐的浓度
增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度,减少因静电的作用(有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间)引起的前拖。
例如:注射用苦参碱的测定
流动相中加入适量的四氢呋喃
往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度,很多色谱工作者都知道和使用,但其机理似乎少人提及。通常所加入的量在5%以内即可,需要的时候可以加入更大的量。
升高柱温的温度
升温有助于增加流动相传质速率,减少因静电作用引起的前拖,但温度不宜太高,温度太高容易损伤色谱柱,特别是含有离子对试剂的时候,最好不要超过40度。
03
其它峰形问题
裂峰
柱头污染和柱头塌陷都会造成裂峰,最常见的原因是筛板上颗粒物堵塞样品进入色谱柱不均一,只需反冲色谱柱将颗粒物除掉就可解决。
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