【应用分享】细胞培养基中水溶性维生素的检测

纳谱分析技术(苏州)有限公司

2024/09/19 14:49

细胞培养是生物治疗药物生产的关键环节，细胞培养基为细胞提供了生长所需的环境和条件，为细胞提供必需的营养物质，如氨基酸、维生素、矿物质和糖类，支持细胞的生长和增殖，是细胞培养的基础。

在培养基中，水溶性维生素起着至关重要的作用，它们是细胞生长、代谢和功能维持所必需的营养物质。水溶性维生素主要包括：泛酸、维生素B12、烟酰胺、吡哆醇、吡哆醛、硫胺素、核黄素、维生素C、叶酸、D-泛酸和生物素等。HPLC是测定水溶性维生素的主要方法。准确测定水溶性维生素的含量，是细胞培养过程监测的重要参数之一。由于水溶性维生素属于极性亲水性化合物，在常规的反相色谱柱上保留欠佳，通常需要加离子对试剂，以增强保留，改善分离，但离子对色谱法也给实际应用带来了诸多不便。ChromCore T3色谱柱具有良好的100%水相耐受性，能够有效实现极性和亲水化合物保留。本文采用ChromCore T3色谱柱，结合非离子对的流动相体系，建立了同时测定细胞培养基中10种常见水溶性维生素的分析方法。

将细胞培养基样品加水稀释1倍，直接上机分析。

色谱条件

Column: ChromCore T3, 5 μm

Dimension: 4.6×150 mm

Mobile Phase: A) 50 mM KH₂PO₄ (pH=3.0 by H₃PO₄)

B) MeCN

Gradient: t(min) %A %B

0 100 0

2 100 0

20 80 20

22 40 60

25 40 60

25.2 100 0

30 100 0

Flow Rate: 1.0 mL/min

Temperature: 30 ℃

Injection: 10 μL

Detection: UV 214 nm, UV 262 nm, UV 274 nm, UV 290 nm, UV 362 nm

Instrument: Agilent InfinityⅡ 1260四元

Sample: 10种水溶性维生素混合标准品溶液

线性关系和最低定量限、检出限考察

取已知浓度的10种水溶性维生素混合标准品溶液，加水逐级稀释，制成系列浓度的水溶性维生素混合标准溶液，进样分析，以浓度为横坐标，峰面积响应为纵坐标，考察各目标物的线性相关关系，结果所有目标物的线性相关系数r＞0.999，表明各目标峰线性相关性较好。分别按照S/N=3:1和10:1计算各水溶性维生素的最低检出限 (LOD) 和定量限 (LOQ) ，结果见表1。

表1 10种水溶性维生素线性关系和最低定量限、检出限考察

精密度测试

取水溶性维生素混合标准品溶液，连续进样5次，结果各目标峰保留时间的RSD＜0.2%；峰面积RSD＜1.5%，表明方法精密度良好。

所有目标峰保留时间的RSD＜0.2%；峰面积RSD＜1.5%。

加标回收率测试

取培养基样品3份，其中2份按照高低两水平加入水溶性维生素的混合标准品溶液，另一份作为样品本底，测定所有目标组分的含量并计算加标回收率。结果所有目标物（除D-泛酸外）的加标回收率在99.76-103.87%；D-泛酸由于为末端UV检测，低浓度加标下易受基质成分干扰，测得低浓度加标回收率为118%，高浓度加标水平下回收率为102%。

样品分析

取两种培养基样品，按照前述确定的分析条件上机分析。由图4样品的分析谱图可见，各目标成分在该柱上保留较好，在特定的检测波长下与基质干扰成分的分离良好，可对目标物进行准确测定。

实验结论

本文采用ChromCore T3色谱柱，对细胞培养基中10种常见的水溶性维生素进行了分析。以两种培养基样品为例，各目标物与基质干扰成分分离良好；表明本法准确可靠、精密度较好，可被应用于培养基中水溶性维生素的含量测定。

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