食品中乳铁蛋白的提取与检测（第二代肝素亲和柱+乳铁蛋白结合液）

纳谱分析技术(苏州)有限公司

2024/09/19 14:53

乳铁蛋白是一种具有多种生理活性的天然蛋白质，参与调节免疫功能、抗微生物、调节铁吸收、促进肠道细胞增殖分化等多种生理过程。

今年8月开始实施的《GB 5009.299-2024食品安全国家标准食品中乳铁蛋白的测定》中规定了食品中乳铁蛋白的提取与检测方法，纳谱分析紧跟新国标要求，曾在今年3月份推出第一代SelectCore Heparin肝素亲和柱（货号：HEP065-030001-1）。考虑到乳制品过柱速度慢，纳谱分析近期推出第二代的SelectCore Heparin肝素亲和柱（货号：HEP065-030001-2），相比第一代产品，第二代的肝素亲和柱滴速更快（快30%左右），载量更高（高90%左右），适用于多种固态乳粉和液态奶。另外，针对多个客户反馈国标提取液提取效率不高，需要2~3次才能充分提取，前处理时间较长的情况，纳谱分析开发了一种可以提高提取效率的试剂乳铁蛋白结合液A，进行一次提取就可以达到之前三次提取的效果，我们经过多种固态乳粉和液态奶的测试，与标示量数据都较为接近，可以大大加快乳铁蛋白项目的前处理时间。

适用范围

本方法适用于巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料、调制乳粉及乳基婴幼儿配方食品中牛乳铁蛋白含量的测定。

一、实验步骤

试剂配制

磷酸盐缓冲液Ⅰ：称取7.1 g磷酸氢二钠、58.4 g氯化钠，加900 mL水溶解，用磷酸调pH至8.0±0.2，加水定容至1000 mL，临用现配。

磷酸盐缓冲液Ⅱ：称取28.4 g磷酸氢二钠，加800 mL水溶解，用磷酸调节pH至7.5±0.2，再加入20 mL乳铁蛋白结合液A，加水稀释至1000 mL。

0.1%三氟乙酸溶液：量取1 mL三氟乙酸注入900 mL水中，用水稀释至1000 mL，过0.45 μm滤膜。

样品的制备

2.1 液态试样（巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料）

称取5 g（精确至0.01 g）试样，置于25 mL容量瓶中，加入10 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ，涡旋30 s，用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度，在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min，吸取中间层澄清溶液20 mL至50 mL容量瓶中，再次在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min，吸取中间层液体待净化。

2.2 固态试样（调制乳粉、乳基婴幼儿配方食品）

称取1 g（精确至0.01 g）试样，置于50 mL容量瓶中，加入20 mL温热（温度不超过45 ℃）的磷酸盐缓冲液Ⅱ，涡旋30 s，冷却至室温，用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度，在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min，吸取中间澄清层溶液30 mL至50 mL离心管中，再次在4 ℃条件下10000 r/min离心15 min，吸取中间层液体待净化。

固相萃取法

SelectCore Heparin肝素亲和柱1mL；

活化：肝素亲和柱使用前先加入5.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ活化；

上样：准确移取10.0 mL上述样液过柱，控制流速在1 mL/min~3 mL/min；

淋洗：待样液滴完后，用10.0 mL磷酸盐缓冲液Ⅱ淋洗，弃去流出液；

洗脱：用4.8 mL磷酸盐缓冲液Ⅰ分两次洗脱，收集洗脱液并用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至5.0 mL，供上机检测分析用。

注：在样品过柱前，可根据实际样品中乳铁蛋白含量调整具体上样液体积（纳谱分析SelectCore Heparin肝素亲和柱（货号：HEP065-030001-2）柱容量是10 mg）。

液相色谱仪器条件

Column: ChromCore 300 C4-T，5 μm

Dimension: 4.6×250 mm

Mobile Phase: A）0.1%三氟乙酸溶液

B）乙腈

Gradient: t(min) A B

0 85 15

20 15 85

22 85 15

25 85 15

Flow rate: 1.0 mL/min

Temperature: 30 °C

Injection: 50 μL

Detection: UV 280 nm

二、实验谱图及结果

实验谱图

由色谱图和加标回收率数据可以看出，纳谱的乳铁蛋白结合液A能够提高磷酸盐缓冲液Ⅱ的提取效率，只需提取一次即可，缩短了提取时间，并且加标回收率也符合国标要求。

Tips：

（1）乳铁蛋白结合液A放置时间过长可能会出现沉淀，使用前摇匀即可；

（2）配制磷酸盐缓冲液Ⅱ时，调pH前的溶液pH值应在9.00以上，否则提取效率会降低。调完pH后加乳铁蛋白结合液A然后定容，定容后混匀即可，不需要剧烈搅拌；

（3）如不想使用乳铁蛋白结合液A，样品提取的次数需要增加，特别是配方奶粉，定容体积不变的情况下需进行少量多次提取才能提取比较充分；

（4）纳谱分析的SelectCore Heparin肝素亲和柱采用的是可穿透的上盖，如果需要加体积较大的溶液，可以直接在小柱上面加一个12 mL的SPE上样柱或20 mL注射器即可；如果希望在更大体积的亲和柱上一次性把10 mL提取液全部加上去，可以选择SelectCore Heparin RC肝素亲和柱（该产品是为大体积上样用，填料类型和规格不变），如图3所示；

（5）固相萃取过程中的上样步骤，如果滴速过慢可适当加压，流速控制在1 mL/min~3 mL/min即可；

（6）固相萃取过程中的洗脱步骤需要用4.8 mL磷酸盐缓冲液Ⅰ分两次洗脱；

（7）实验观察到部分聚醚砜材质的滤器对乳铁蛋白会有大概10%左右的吸附，目前测试下来，经过Heparin固相萃取柱净化后的溶液较为澄清，可以不过膜进样；

（8）首次使用ChromCore 300 C4-T色谱柱时，可能会出现色谱峰型不对称或响应低的情况，此时需要使用高浓度牛乳铁蛋白对照品（400 μg/mL进样100 μL）对色谱柱进行钝化处理，钝化后将色谱柱冲洗至无牛乳铁蛋白的目标峰后，再进行样品分析；

（9）因为蛋白在C4分析柱上会有一定残留，建议在做柱容量测试后，空针进样两次把蛋白残留降低后再进行后续测试；

（10）ChromCore 300 C4-T色谱柱使用结束后，需用纯乙腈冲洗30 min对色谱柱进行保存，保证下次色谱柱可以正常使用。

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