方案摘要

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应用领域	医疗/卫生
检测样本	内脏器官
检测项目
参考标准	COVID-19,新型冠状病毒病,气道上皮模型

基于细胞的体外预测模型可能支持国际上开发新疫苗和其他治疗肺相关疾病（如 COVID-19、慢性阻塞性肺病或特发性肺纤维化）的努力。将3D生物制造与气液界面培养相结合，可以对组织模型进行工程改造，从而在体外重现健康和患病状态下呼吸道的典型特征。这些模型不仅提供了深入了解病毒与靶位点宿主细胞相互作用的潜在机制的机会，而且还有助于减少未来研究中使用的动物数量，从而支持 3Rs（替换、减少和细化）原则。在这项研究中，我们描述了 3D 生物制造气道上皮模型的生成及其生理相关性的评估。该模型的特点是血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 的表达，ACE2 是冠状病毒内化所需的一种蛋白质。 ACE2蛋白定位于顶膜表明上皮细胞是极化的，粘蛋白5AC蛋白的存在表明该模型可以产生气道表面液体，这是气道上皮细胞的一种生理功能。因此，这些生物工程组织模型可用于开发不同的疗法和疫苗。

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配置单

Cellink BIO CELLX 3D生物打印机
型号：BIO CELLX

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Cellink BIO X6 3D生物打印机
型号：BIO X6

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方案详情

介绍

2019年底出现的新型冠状病毒病（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的。该病毒具有高度传播性，并使用血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 作为主要受体进入哺乳动物细胞。ACE2 是一种细胞表面蛋白，存在于许多细胞和组织中，包括肺、心脏、血管、肾脏、肝脏和胃肠道(Hamming, 2004)。 ACE2 在健康肺组织中适度表达，在慢性阻塞性肺病 (COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、哮喘、糖尿病和高血压等病理状况中高度表达 (Saheb Sharif-Askari, 2020)。众所周

知，SARS-CoV-2 会感染呼吸道并传播到整个人体，导致多器官感染症状（de Melo，2021 年）。因此，由于病毒对人类健康的严重影响，开发新的诊断方法、疫苗和抗病毒药物迫在眉睫。

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在这项研究中，我们专注于生物打印原代人支气管上皮细胞或 Calu-3 细胞以生成气液界面 (ALI) 模型。Calu-3 是一种分化良好且具有特征的细胞系，来源于人支气管黏膜下腺 (Zhu, 2010)。人肺的黏膜下腺是气道表面液体、粘蛋白和其他免疫活性物质的主要来源。

生物打印的肺病模型在 Transwell 插入物中培养 14 天，并对 ACE2 和粘蛋白 5AC (MUC5AC) 蛋白进行免

疫染色。使用本应用说明中介绍的实验装置，可以研究宿主-病原体与 SARS-CoV-2 和气道上皮细胞的相互作用（Zhu，2010）。

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图 2. 第 7 天 (D7) 和第 14 天 (D14) 肺组织模型在 10 倍放大时的 H&E 染色。位于构建体顶部的 Calu-3 和 HBE 细胞的上皮层。比例尺=100 µm。

材料和模型

细胞准备

在肺组织模型中使用了两种不同的上皮细胞类型：人支气管上皮细胞（HBEpC；C-12640，PromoCell）和 Calu- 3（肺腺癌细胞衍生的上皮细胞；HBT-55，ATCC）。人肺成纤维细胞（HPF；C-12360，PromoCell）用作支持细胞。在根据各自制造商的协议进行生物打印之前，将细胞解冻并在 2D 中扩增。 HBEpC在气道上皮细胞生长培养基（C-21060，PromoCell）中培养，HPF在补充有生长培养基2试剂盒（C-23020，PromoCell）的成纤维细胞生长培养基2中培养，分别用于第4代和第9代；而 Calu-3 细胞在补充有 10% 胎牛血清 (FBS; 10270106, Gibco Thermo Fisher Scientific) 和 1% 青霉素-链霉素-新霉素混合物 (PSN; 15640055，Gibco Thermo Fisher Scientific）并用于第 4 段。

肺组织模型的生物打印

肺模型被设计成一个圆盘，底部有一个实心层，顶部有一个 5 层边缘（图 1A、1B）。这样做是为了促进接种后上皮细胞的包埋。该磁盘是用 GelMA-Laminin 521 (GelMA-LN521, CELLINK) 3D 打印的。接下来，将 2 x 106 HPF 用胰蛋白酶消化、洗涤、收集、旋转并轻轻重悬于 100 µL 成纤维细胞培养基 2 中，然后将其小心地混合到1mLGelMA-LN521生物墨水中，预热至37°C并转移到琥珀色墨盒中（ CSO010311502，CELLINK）。为了去除截留的气泡，将嵌入 HPF 的 GelMA-LN521 滤芯以 460g 离心 1 分钟。在开始打印会话之前，将墨盒安装在 BIO X™ 生物打印机中设置为 27°C 的温控打印头（00000020346，CELLINK）中 20 分钟。将药筒倒置 2 至 3 次以避免细胞沉淀。 GelMA-LN521 生物墨水的合适生物打印温度为 26°C 至 27°C。然后在 12 孔板中使用温控打印头在 27°C 下对圆盘篮进行生物打印。首先使用 405 nm 光固化模块（距离设置为 5 厘米）对每个构建体光固化 12 个圆盘复制品，并将成纤维细胞生长培养基添加到每个孔中。然后在添加上皮层之前，将圆片在成纤维细胞生长培养基中于 37°C 孵育 3 天。