细胞培养被支原体污染是极普遍的问题,面对支原体污染给细胞培养带来的巨大难题,世界各国开始重视,并相继建立了细胞库,对细胞质量进展控制,效果显著,支原体污染的问题得以限制。目前已知能污染细胞的支原体有20多种以上,其中95%以上的支原体污染是口腔支原体。
支原体在自然界分布广泛,无细胞壁,直径为0.1-0.3μm,且形态易变,极易通过除菌过滤器。大部分支原体繁殖速度比细菌慢,适宜生长温度为35℃,适合于偏碱条件下生存(pH7.6—8.0),对酸耐受性差,对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多,需要频繁换液才能维持传代培养的时候,即应怀疑支原体污染。细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体:口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体,其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。
支原体的污染来源
(1)细胞之间交叉污染;
(2)细胞培养操作人员的口腔、皮肤等;
(3)工作环境或实验器材的污染;
(4)培养基的污染。
支原体污染的检测及鉴定方法
01、培养法
培养法为最为经济可靠的方法,但其实验周期较长,所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。
(一)材料与设备
1. 精氨酸肉汤培养基 按说明称量粉剂,蒸馏水配制, 高压除菌(加20%胎牛血清)。
2. 支原体琼脂培养基 按说明称量粉剂,蒸馏水配制,高压除菌(加20%胎牛血清)。
3. 其他 超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管/皿、37°C 培养箱。
(二)操作步骤
1. 样品的储存。样品取材后,最好尽快进行检测。样品如在24h 以内进行支原体检测, 可储存在2~8℃; 如果超过24h 样品应放置于-20℃ 以下保存。-20℃保存的样品,进行检测时需重新加入到对照培养细胞中,培养72h 后,取上清直接进行接种检测。
2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基(半流体)。
3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中(已冷却至36℃) ,每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基,3 支半流体培养基。
4. 接种6d 后,取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。
5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。记录实验结果。
(三)结果判断
培养结束时,精氨酸肉汤培养基如有支原体生长,则液体颜色改变(粉色或黄色) 。
半流体培养基中如有支原体生长,则出现絮状沉淀
02、荧光染色法
荧光染色法检测支原体污染是利用荧光染料进行支原体污染的拣择方法。荧光染色法检测支原体污染的基本原理用特异荧光染料(Hoechst 33258)染色后在荧光显微镜下进行检测。荧光染料(Hoechst 33258)是一种能和 DNA 特异结合物质。如果,检测样品为支原体污染,则附在细胞表面的支原体 DNA 着色,在荧光显微镜下可见。
(一)材料与设备1. DMEM 完全培养基及无抗生素的 DMEM 培养基2. 二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst 33258)3. 固定液4. 细胞培养 6 孔板或其他容器5. 荧光显微镜6. 二氧化碳培养箱
(二)操作步骤
1. 盖玻片培养细胞汇合前从瓶中取出;细胞最好处于 70% 汇合,如细胞完全汇合,能影响支原体的观察。2. 漂洗将细胞盖片置于培养皿中,用不含酚红的 Hanks 液漂洗;细胞悬液则先离心去上清营养液后,再加入 Hanks 液漂洗。3. 固定加入固定液 5 ml,放置 10 min。4. 漂洗用生理盐水或去离子水漂洗,方法同(2)。5. 染色加入二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst 33258)工作液 5 ml,在室温下放置 10 min。6. 观察取出盖玻片空气中干燥,细胞面向上,滴加 pH5.5 的磷酸缓冲液数滴,覆以盖玻片,在荧光显微镜下观察。
(三)注意事项
1. 盖玻片培养细胞达到 70% 汇合观察效果最佳,不要使细胞完全汇合。2. 在空气中干燥时,盖玻片的细胞面向上。
03、PCR法
该实验具有灵敏度高、特异性强、快速的特点,但其对实验环境的要求严格,实验成本较高,有时还有假阳性的现象出现。
PCR 法检测支原体污染的基本原理是酶促 DNA 合成反应,即在 DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下,经 DNA 聚合酶的作用,使 DNA 链扩增延伸。
(一)材料与设备
1. 支原体检测试剂盒(内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean 树脂、缓冲液;)
2. dNTP3. Taq DNA 聚合酶4. 缓冲液5. 琼脂糖6. 矿物油7. 超净工作台8. PCR 仪9. 电泳仪10. 凝胶成像分析系统11. 台式离心机12. 旋涡混悬器
(二)操作步骤
(1)样品的收集
待测细胞用无双抗培养基培养 7 d,用无菌容器取上清液 500 μl,4 ℃ 保存待测。
(2)模板的制作
在无菌的条件下,取细胞培养上清液 100 μl 于一无菌的 0.5 ml 塑料离心管内,盖好盖子,95 ℃ 水浴加热 5 min。
(3)打开盖子,向管内加 StrataClean 树脂 10 μl,盖好盖子,旋涡混悬器混合,离心 5~10 s,吸取上清至一新的塑料离心管中,模板制作完毕,4 ℃ 保存。
(4)PCR 反应反应体系最适条件为:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.38),50 mmol/L KC1,1.5~2.5 mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP,2U Taq DNA 聚合酶;总反应体系为 50 μl,反应用去离子水均需用 12000 μJ/c㎡紫外灯照射。
A. 在 0.5 ml 塑料离心管中加入 35.2 μl 去离子水及 5 μl 10 x Taq 反应缓冲液。
B. 依次加入下列成分:0.4 μl dNTP(25 mmol/L);0.4 μl Taq 酶(5 U/μl);2 μl 引物。
C. 加 2 μl 去离子水,总体积 45 μl。
D. 加 5 μl 已制成的模板到反应体系中。
E. 阳性对照、内对照各 5 μl 加入到各自的反应体系中。
F. 取 1 支含有以上反应体系的离心管,加入 5 μl 去离子水作为阴性对照管。
G. 在反应体系中加入 100 μl 矿物油。
H. PCR 程序:
程序 | 循环数/次 | 温度/℃ | 时间/min | 程序 | 循环数/次 | 温度/℃ | 时间/min |
1 | 1 | 94 | 2 | 2 | 40 | 94 | 1 |
50 | 2 | 50 | 1 | ||||
72 | 2 | 72 | 2 |
(5)琼脂糖凝胶电泳PCR 反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度 2%。电泳结束后,凝胶成像分析结果。
(三)注意事项
1. PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。
2. 检测前,待测细胞要用无双抗培养基培养 7 d。
04、扫描电子显微镜法
扫描电子显微镜法:扫描电子显微镜法非常直观、准确,对使用环境要求高,操作复杂,实验周期较长,常作为样品的最后定性检测。
(一)原理
利用电子显微镜的超级放大功能, 直接观察培养细胞中支原体污染情况。
(二)材料与设备
待检测细胞, 0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA 、2.5%的戊二酸、1%锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液( pH7.4 ) ,扫描电镜及相关设备。
( 三)操作步骤
1. 将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。
2. 37°C , CO2 培养箱中培养24h , 取出盖玻片。
3. 以PBS 洗涤3 次。
4 . 以2 .5%戊2醛/PBS 固定15min , PBS 洗涤。
5 .以1%锇酸固定30min, PBS 洗涤。
6 . 乙算异戊酯脱水。
7. CO2 冰点干燥。
8. 喷金。
9 . 扫描电镜观察,照相。
(四)结果分析
以上就是小编整理的四种支原体检测方法,希望对大家细胞培养能有所帮助。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去,是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。同时预防支原体的污染也很关键。这期内容就到这里结束啦!
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