实验室常见菌株保存方式比较!
一、菌株保存要求
菌种作为一项重要的生物资源,对微生物学教学和研究是必不可少的。菌种保存方法因微生物的不同而异。在菌种保存过程中,必须使微生物的代谢处于z不活跃或相对静止的状态,才能在一定的时间内不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素,故菌种保存方法多依据这三个因素而设计。
菌种保存方法有多种,z理想的为真空冷冻干燥法,具有保存时间长、成活率高、变异小等优点,但操作技术难度大,花费高,需特殊设备,一般单位不易做到,而一些常规方法,常因传代次数多、易污染、易变异,给保存带来诸多不利。
多年来,微生物学工作者们一直在研究摸索简便而行之有效的菌种保存方法,笔者查阅相关资料并吸取同行工作者们的实践经验,总结了几种方法简便、效果好的保存方法,现介绍如下。
二、需要4℃冰箱保存的保存法
1、液体石蜡保存法
先将液体石蜡灭菌,然后放于37℃恒温箱中,使水汽蒸发掉备用。再将需要保存的菌种在z适宜的斜面培养基中培养,用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡,注入已长好的斜面培养基上,用量以高出斜面顶端1cm 为准。试管需直立,置4℃或室温下保存,一般无芽胞细菌可保存1年左右。
2、高层半固体琼脂石蜡保存法
将需保存的菌种经平板划线分离后,挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高层半固体琼脂培养基中,经37℃12小时培养后取出,用无菌操作将灭菌的液体石蜡滴加半固体琼脂菌种管表层约0.5cm高度,存放4℃冰箱,1年转种1次。
3、蒸馏水保存法
取灭菌蒸馏水6-7ml加于试管斜面上,用吸管研磨,洗下菌苔充分混匀,将此菌液分装于灭菌的螺旋小瓶中,或用胶塞密封,置4℃保存可存活数年。
三、需-20℃冰箱冷冻保存的保存法
1、甘油保存法
甘油一生理盐水保存液的制备:取甘油(分析纯)8份加入生理盐水2份,充分混合后,经121.3℃ 30分钟灭菌备用。
将纯化后的菌株根据菌种不同分别划线接种于其z适宜生长的培养基上培养后,用接种针取典型菌落接种肉汤管37℃培养6-8小时(链球菌和奈瑟氏菌接种血清肉汤管,5-10%CO2环境下8-10小时培养,真菌直接用接种环取菌洗入肉汤管,不培养)。此为培养液。
将此培养液与保存液以5:2的比例混合分装于灭菌的微量离心管,置-20℃冰箱保存(链球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用时需37℃水浴中快速解冻。
用上述方法保存一般菌株可存活3年以上,链球菌、奈瑟菌可存活12-15个月,且性状未发生变异。此方法采用幼龄肉汤培养物效果好,且适用于链球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种。
2、低温保存法
菌种保存液的配制:K2HPO412.6g,柠檬酸钠0.98g,MgSO4·7H2O 0.18g,KH2PO4 3.6g,甘油88g加蒸馏水至1000ml,103.4KPa灭菌30分钟,4℃保存备用。
将细菌接种于肉汤培养基中,37℃ 培养16-18小时,或斜面培养物刮取于生理盐水中,然后加入等体积的菌种保存液,冻存于-70℃或-20℃冰箱中。
此方法也适合甲链、肺球、流感杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌等耐受力低的细菌。-70℃保存10年以上,-20℃可保存2年以上。
3、细菌湿种牛奶冻存法
新鲜牛奶或15%奶粉煮沸,冷却脱脂,分装小试管,每管1ml,8磅15分钟灭菌备用。
将纯种菌接种于平板,37℃16小时培养,以接种环刮取菌苔2-3环于牛奶中混匀,试管用硅胶塞,冻存于普通冰箱冷冻室(-12℃-18℃)。使用时取出室温溶解,待部分溶解时即可取一环接种平板,并将试管再迅速冻存,这样可反复使用3-5次。此法一般菌株可存活48个月,少数如奈瑟氏菌、甲链、白喉等可存活14-30个月。
4、甘油原液保存法
将各待保存的菌种纯化后用接种环直接从平板上刮取,置于盛有0.5ml甘油原液的菌种瓶中,-20℃保存,可连续52个月存活良好。
此法尤其适合乙链、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌种,是一种简便实用的有效保存方法。
四、需低温-30或-70℃冰箱保存
1、脱纤维羊血
无菌抽取羊颈静脉血后,沿瓶壁注入无菌的带玻璃的三角烧瓶中,同时立即同一方向振摇约8-10分钟,脱去纤维,然后分装加盖无菌小试管中约1.0-1.5ml。
将脑膜炎双球菌、淋球菌、甲乙型链球菌、肺炎双球菌分别接种于血平板培养基中,前两者置于5-10% CO2 烛缸内,经35℃16-18小时培养,后三者置37℃恒温箱培养24小时,然后无菌操作取一接种环菌苔移种于上述新鲜脱纤维羊血试管中,立即置-3O℃冰冻保存二年转种一次。用时室温自然冰融即可接种。
2、纸片法
新华定性滤纸剪成4mm×4mm,1.5ml带盖离心管消毒灭菌备用,用消毒小钳子钳上滤纸片于平板上刮取待保种的纯菌落2-3个。放于离心管内塞盖再用封口胶布将盖边缘封好放于-30℃冰箱保存。保存12个月后取出菌种解冻后用无菌钳取一片放于肉汤管内37℃培养12小时后转种血平板,性状未变异。
3、奶粉液菌种保存法
菌种保存液:脱脂奶粉10g,NaCL 10.5g,加双蒸水100ml,121℃ 5分钟高压灭菌后分装于1ml带盖无菌标本杯中(0.5ml)备用。
无菌操作用4mm×10mm 无菌滤纸条蘸取新鲜菌少许,放存含奶粉液保存杯中,盖好,封口胶封口,低温保存。3年存活率达99.2% 。
使用时将标本杯取出,不等全部融化,上层有少许融化即用接种环取一少许接种于血平板分离即可。
五、结论
菌种是细菌工作中所不可缺少而又具有传染性生物学因子。为了保证工作和安全,对菌种必须妥善保存和保管。保存菌种不仅要求不死,还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异,这是保存菌种的重要环节。延长菌种存活期应注意:首先,待保存菌种须选择生长期幼龄培养物,且制成浓菌液保存,以保证存活率。其次,高层半固体培基z好选择不含或含糖量低的培基,可减少或避免因代谢产物产生而造成的细菌死亡。z后,保存温度的高低可影响存活率,切忌反复冻融。
以上介绍的几种方法,取材简单,操作容易,已经反复实践证明保存时间长,变异小,适合中小型实验室使用。
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