支气管上皮细胞的应用与研究方法!
一、背景
支气管上皮细胞分离自正常支气管上皮组织,气管管壁分粘膜、粘膜下层和外膜三层。
粘膜表面为假复层纤毛柱状上皮,由纤毛细胞、杯状细胞、基细胞、刷细胞和弥散的神经内分泌细胞等组成。纤毛细胞呈柱状,游离面有纤毛,每个细胞约有300根,核卵圆形,位于细胞中部。
纤毛向咽侧呈快速摆动,将粘液及附于其上的尘粒,细菌等异物推向咽部被咳出,故纤毛细胞有净化吸入空气的重要作用。
杯状细胞也甚多,其结构与肠道上皮的杯状细胞相似,顶部胞质内含大量粘原颗粒,细胞分泌的粘蛋白(mucin)是一种大分子糖蛋白,它与管壁内腺体的分泌物在上皮表面共同构成一道粘液性屏障,粘附吸入空气中的异物,溶解吸入的SO2、CO等有害气体,随粘液咳出。
基细胞呈锥形,位于上皮深部,是一种未分化的细胞,有增殖和分化能力,可分化形成前述两种细胞。
刷细胞(brush cell)呈柱状,游离面有许多排列整齐的微绒毛,形如刷状。刷细胞的功能尚不清楚,可能有一定吸收作用。细胞顶部可见基粒,因此认为它可能是一种未成熟的纤毛细胞。有的刷细胞基部可见与传入纤维构成的突触,故它还可能有感受刺激的功能。
气管及其以下分支的导气部管壁上皮内还有弥散的神经内分泌细胞,细胞呈锥体形,散在于上皮深部,胞质内有许多致密核心颗粒,故又称小颗粒细胞(small granule cell)。
免疫细胞化学研究证明,细胞内含有多种胺类或肽类物质,如5-羟色胺、蛙皮素、降钙素、脑啡肽等,分泌物可能通过旁分泌作用,或经血液循环,参与调节呼吸道血管平滑肌的收缩和腺的分泌。
二、应用
用于Th2/Th17偏转微环境对人支气管上皮细胞重塑的作用及其机制研究:
研究IL-4/IL-17A介导的Th2/Th17偏转微环境对气道上皮重塑的影响。并探讨其信号转导途径及逆转上皮重塑的可能途径。
三、方法
1、TGF-β1、IL-4和IL-17A对气道上皮细胞的增殖抑制作用:以人支气管上皮细胞株16-HBE细胞为研究对象,采用CCK-8法检测TGF-β1、IL-4和IL-17A对16-HBE细胞上清液中OD值的影响。
2、IL-4/IL-17A介导的Th2/Th17偏转微环境对气道上皮细胞间质转变的影响:以16-HBE细胞为研究对象,使用光学显微镜观察TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞的形态学变化;采用免疫细胞化学法检测TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞中a-SMA蛋白表达水平的变化;采用RT-PCR、Western Blot方法检测TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞中上皮-钙粘蛋白(E-cad)、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)mRNA和蛋白表达水平的变化;采用ELISA法检测TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞上清液中Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PINP)表达水平的变化。
3、TGF-β1、IL-4和IL-17A在促气道上皮EMT中的信号转导通路研究:以16-HBE细胞为研究对象,采用Western Blot方法检测不同时间点TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE细胞中EGFR和p-EGFR、Smad3和p-Smad3、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平的变化;使用U0126(ERK途径拮抗剂)抑制TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所诱导的16-HBE细胞中ERK1/2活化,采用RT-PCR、Western Blot方法观察U0126在上皮间质转变中的作用。
4、PPAR-γ激动剂抑制气道上皮细胞间质转变的研究:使用PPAR-γ激动剂罗格列酮(RGZ)干预TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所诱导的16-HBE细胞,采用RT-PCR、Western Blot探讨罗格列酮对气道上皮EMT的作用及可能机制。
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