变形杆菌的致病与耐药性及检测方法!
一、背景
变形杆菌是一种革兰染色阴性杆菌。存在于肠道和前尿道。为尿路感染、急性腹膜炎和大面积烧伤感染的致病菌之一。该菌对大多数抗生素有耐药性。其脓液有特殊的恶臭味。对变形杆菌感染可用头孢菌素类药物治疗。变形杆菌中最常见一种为奇异变形杆菌,奇异变形杆菌是具有细胞迁徙现象的兼性厌氧菌,营养需要不高,广泛存在于泥土、水和机体消化道中,有周鞭毛,运动活泼。
奇异变形杆菌与感染相关的毒力因子主要为高黏附性的菌毛、荚膜多糖、各种蛋白水解酶以及具有细胞毒活性的溶血素如HlyA、HpmA、HpmB 等。菌毛增加了细菌的侵袭力,蛋白水解酶促进感染扩散并帮助菌株逃避免疫系统的攻击,荚膜多糖不仅增加了细菌黏附性,其的生物被膜更阻断了抗菌药物的杀菌抑菌作用,因此奇异变形杆菌导致的感染往往比较严重而且难以治疗。
二、致病性
奇异变形杆菌是变形杆菌属临床最常见的病原体,是导致泌尿系统感染排名第2 位的肠杆菌科细菌,仅次于大肠埃希菌。在院内感染中,由奇异变形杆菌引起的比例占到3%。奇异变形杆菌还可以引起肠道感染,目前我国公布的细菌性食物中毒病原谱中,奇异变形杆菌仅次于副溶血弧菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌,是引起食物中毒的第四大主要病原菌。奇异变形杆菌还可引起血流感染,病死率较高,值得关注。
三、耐药性
随着抗生素的大量不规范使用,奇异变形杆菌的耐药性不断增强,1991 年,法国首次报道了产β -内酰胺酶的奇异变形杆菌。随后,美国、法国、日本、中国等国家陆续报道携带不同类型β-内酰胺酶的奇异变形杆菌。耐多药奇异变形杆菌和耐碳青霉烯奇异变形杆菌的出现,给临床治疗提出了极大的挑战
1、对β-内酰胺类抗菌药物的耐药流行情况
奇异变形杆菌因青霉素结合蛋白2( PBP2) 的功能缺陷,对亚胺培南天然不敏感,最低抑菌浓度MIC值在16 ~64 μg /ml之间。1991 年法国首次报道了产β-内酰胺酶奇异变形杆菌。
1995 年美国报道了产TEM-10β -内酰胺酶的临床来源奇异变形杆菌。从1998 年至今,南非、意大利、西班牙、希腊、巴西、日本、保加、中国、欧洲、瑞士、阿根廷、韩国、中国台湾、俄国、波兰、以色列、中国香港等多个国家和地区报道了产各种类型β-内酰胺酶的奇异变形杆菌。2008 年美国首次报道了产KPC 碳青霉烯酶的奇异变形杆菌,对亚胺培南、美罗培南、厄他培南均耐药。
近几年波兰和法国又陆续报道了产VIM-1型和产NDM-1 型碳青霉烯酶的奇异变形杆菌。近25 年有关奇异变形杆菌耐药报道中,最多的是产β-内酰胺酶的奇异变形杆菌,分布于世界各地,有很多种类型,包括广谱β-内酰胺酶( ESBLs) 、头孢菌素酶( AmpC) 和碳青霉烯酶等,其中ESBLs 以TEM 型和CTX-M 型为主,头孢菌素酶以CMY 型为主。近年来,奇异变形杆菌对第三代头孢菌素等的耐药率不断上升,产ESBL 和( 或) AmpC酶是奇异变形杆菌对头孢菌素耐药最重要的机制。
2、对喹诺酮类抗菌药物的流行情况、主要耐药基因类型及相关耐药机制
2000 年美国报道奇异变形杆菌对喹诺酮类抗菌药物的敏感性开始下降,环丙沙星( CIP) 的MIC90 > 512 μg /m;随后日本、中国、希腊、韩国、意大利、中国香港陆续报道了耐喹诺酮类抗菌药物的奇异变形杆菌。奇异变形杆菌对喹诺酮类抗菌药物耐药主要是和染色体上的喹诺酮耐药决定区( QRDRs) 突变相,是gyrA、gyrB 和parC 基因发生点突变引起的。
gyrA 上发生的点突变为83 位点上的丝氨酸突变为异亮氨酸或者精氨酸,或87 位点上的谷氨酸突变为赖氨酸; gyrB 上发生的点突变为466 位点上的谷氨酸突变为天冬氨酸,或464 位点上的丝氨酸突变为酪氨酸或者苯丙氨酸;parC 上发生的点突变为80 位点上的丝氨酸突变为异亮氨酸或精氨酸。不同国家来源的不同耐药菌株具体的突变位点不同,但均发生在上述3 个基因上,可能只有1 个,或2 个基因上的位点发生了点突变,也或是3 个基因的氨基酸位点均发生突变。QRDRs 基因突变是株对喹诺酮类药物高水平耐药的主要原因。
同时,质粒携带的耐药基因也介导了菌株对喹诺酮类抗菌药物敏感性降低,如qnrC、qnrA、qnrD 和aac( 6’) -Ib-cr 等。还有研究报道AcrAB 外排泵的过度表达和前述的QRDRs上的点突变协同导致对喹诺酮的高水平耐药。
3、耐多药的奇异变形杆菌的流行情况
2001 年意大利首次报道了耐多药的产广谱β-内酰胺酶的奇异变形杆菌,接着美国、欧洲、波兰、中国香港、巴西、中国、韩国等多国家和地区均报道了耐多药的奇异变形杆菌,呈现出向全球蔓延的趋势。最近法国报道了从犬体表分离的耐多药奇异变形杆菌,提示多重耐药菌株可以在人和动物之间传播。香港也在鸡肉制品中发现了耐多药的奇异变形杆菌。
四、检测方法
食源性疾病发病率较高,由沙门氏菌,志贺氏菌,金黄色葡萄球菌,变形杆菌,霍乱弧菌,副溶血性弧菌以及E.coli O157:H7,轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒,其发病率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例,是一个严重的公共卫生问题。目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方法。病原体分离虽然是金标准,但繁琐费时,一般需要5天时间,最长需要一个月时间,而且免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
有研究开发了一种变形杆菌检测用引物,其特征在于,能扩增靶基因的特异碱基序列,所述靶基因为变形杆菌的ureR---GenBank登陆号:Z18752,所述引物与所述靶基因的586位---810位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
利用上述引物组的基于环介导等温扩增法检测变形杆菌的检测方法是通过如下技术方案实现的:以变形杆菌的ureR(Z18752)基因序列的586位---810位的核酸序列的一部分或其互补链为靶,通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域,确认是否存在有扩增产物。
具体检测方法为:
1)样品处理和模板提取,样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本;细菌待检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后,取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟,弃其上清液后,用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20~30ul三蒸水煮沸5分钟,再取2ul上清液做待检模板DNA;
2)变形杆菌的环介导等温扩增(LAMP)取扩增反应液,先加待检模板,再加酶,最后加双蒸水,形成如下总体积为20ul~100ul的反应体系,混匀点离后在约60-65℃条件下恒温保温约60-90分钟,然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶。反应体系为(反应总体积20ul~100ul);
3)LAMP反应产物的检测:A)肉眼检测:与阴性对照管比较显示,检测管出现明显浑浊为阳性,未见浑浊为阴性;或,B)加染料后检测:每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I(invitrogen)1-2ul,1-5分钟观察结果,反应液变绿为阳性,保持无色或棕色为阴性;或,C)电泳检测:2-3%琼脂糖凝胶,70V电泳约60-100分钟,电泳图片显示LAMP特征性梯状条带,最小片段在160bp左右,则结果为阳性;如无任何条带则结果为阴性。
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