小鼠肾足突基底膜组织提取物的背景与应用!
一、背景
小鼠肾足突基底膜组织提取物是小鼠肾足突基底膜组织提取产物包含小鼠肾足突基底膜组织不同种类的细胞可以直接用于基因克隆,表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。肾足突基底膜是肾小球过滤膜的一部分,组成滤膜的中层。
足细胞(podocyte),即肾小囊脏层上皮细胞,它附着于肾小球基底膜(GBM)的外侧,连同血管内皮细胞和肾小球基膜一起构成了肾小球血液滤过屏障。足细胞特殊的解剖位置,使得其体内研究较为困难;又由于正常成年机体的肾脏足细胞是一种终末分化细胞,体外培养的原代细胞不能增殖。足细胞呈星型多突状,胞体较大,由胞体伸出许多突起,又称足突(FP),呈指状交叉覆盖于GBM外表面,并通过黏附分子和蛋白多糖分子与GBM相连。
扫描电镜观察,可见胞体伸出几个大的初级足突,进而分出许多指状的次级突起。相邻两个足细胞之间的次级突起相互交错穿插,形成栅栏状,紧贴于毛细血管基膜外面。两相邻的足细胞之间的裂隙称为裂孔,直径约为25nm(也有的书刊标注为40nm),其表面覆盖着一层拉链状的结构-裂孔膜,厚度约为4-6nm,是血浆蛋白滤液的最后屏障,也是液体进出足细胞的地方。裂孔表面有硫酸蛋白多糖等组成阴离子外衣,是肾小球电荷屏障的重要组分之一。
足突通过肌动蛋白、肌球蛋白等结构蛋白组成的动态的舒张系统调调解着GBM的肌原张力,从而使足细胞连同肾小球内皮细胞和其基膜一起共抵抗毛细血管内的静水压,维持着毛细血管襻的结构稳定。并且足突也可以通过其收缩与扩张改变裂孔的大小和滤过膜的面积,即而改变超滤稀疏,调节肾小球的过滤功能。
足细胞在正常情况下可以分泌GBM的主要组成成分IV型胶原和纤维连接蛋白(FN),在促肾纤维化引资等刺激下还能分泌具有降解GBM作用的基质金属蛋白酶(MMPs)和组织蛋白酶,从而在GBM的代谢平衡中发挥重要作用。
二、应用
小鼠肾足突基底膜组织提取物可用于NOD2通过调控TRPC6离子通道的表达及活性参与高同型半胱氨酸血症引起的肾损伤研究:
同型半胱氨酸是体内甲硫氨酸循环的中间产物,其代谢异常所导致的高同型半胱氨酸血症是终末期肾病(end stage renal disease,ESRD),以及心血管疾病并发症导致的终末期肾病发生发展中的一个独立危险因子,但是高同型半胱氨酸所致肾损伤的发生发展机制迄今尚未完全明确。NOD2(nucleotide binding oligomerzation domain2)属于模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)家族中的NLRs(NOD-1ike receptors,NLRs)亚家族成员,在免疫调控与炎性反应中起着重要的作用,前期研究证实其在肾脏多种细胞中表达并且有实验证明小鼠NOD2缺失对肾脏缺血再灌注和糖尿病肾病中具有保护作用。
TRPC6(transient receptor potential cation channe6,TRPC6)是具有钙离子高选择性的瞬时电位阳离子通道,作为足细胞裂孔膜的重要组成蛋白之一,其过度活化可致足细胞内钙离子浓度增高,从而导致足细胞损伤和功能障碍,引起肾小球疾病发生。但是,高同型半胱氨酸血症中,NOD2是否参与了肾损伤的发生发展,及其是否与TRPC6存在调控关系并参与此病理过程,至今尚未见报道。
为此,本课题分别从体内和体外两方面探讨在高同型半胱酸血症中,细胞内固有免疫受体NOD2在肾小球硬化中的作用以及对TRPC6的调控机制,为防治高同型半胱氨酸症导致的终末期肾病提供新的治疗策略。采用PAS染色观察肾脏的形态学变化和电镜观察足细胞形态学变化;ELISA检测相关致炎因子和趋化因子的水平。分别采用定量RT-PCR、蛋白免疫印迹法和免疫组织荧光化学法,检测NOD2在小鼠肾皮质以及肾小球足细胞中的表达变化。
NOD2对TRPC6通道的调控及小鼠足细胞损伤中的作用体外培养肾小球上皮细胞(足细胞),并经同型半胱氨酸刺激后,分别利用实时定量RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测足细胞中NOD2、TRPC6和nephrin的表达变化;MDP诱导足细胞内NOD2活化,以及高同型半胱氨酸刺激转染shRNA-NOD2质粒获得的NOD2基因沉默足细胞后,重复检测上述指标。
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