正常大鼠肾细胞的应用与培养步骤及实验方法!
一、背景
正常大鼠肾细胞是一种常用的细胞系,源自大鼠肾脏组织,并通过克隆培养而得来。该细胞系具有上皮细胞样的形态,并具有贴壁生长的特性。
正常大鼠肾细胞在体外培养时,推荐使用DMEM培养基,并添加5%的胎牛血清和1%的双抗。该细胞系的传代比例通常为1:2,并在消化2-3分钟后进行。
正常大鼠肾细胞的生长特征是每周可以倍增2至3次,其冻存条件为使用90%的FBS和DMSO的混合液作为冻存液,温度为液氮。
正常大鼠肾细胞广泛用于科学研究,特别是在肾病研究领域中具有重要作用。然而,它并不应用于动物或人类疾病的治疗。
二、正常大鼠肾细胞培养步骤
1、培养基及培养冻存条件准备:
1)准备DMEM培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。
2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。
2、正常大鼠肾细胞处理:
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:
1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4、将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注:第一次传代推荐传代比例为1:2,以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3)正常大鼠肾细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例;
1、细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入2ml完全培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮,加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每1ml的数量分配到冻存管中,注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3、将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
正常大鼠肾细胞可以用于内质网应激和自噬对顺铂诱导NRK-52E细胞凋亡的影响:
通过体外复制“顺铂(Cisplatin)致NRK-52E细胞损伤模型”来模拟顺铂肾毒性,探究顺铂致肾小管上皮细胞凋亡的可能机制,并观察利用内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCA)、自噬抑制剂氯喹(CQ)后肾小管上皮细胞的凋亡情况,为研究其医治靶点奠定理论基础。
实验方法:
1、MTT法检测Cisplatin对NRK-52E细胞活性的影响;
2、Annexin V-FITC/PI双染、流式细胞术检测NRK-52E细胞凋亡率;
3、Western blot检测cleaved caspase-3、GRP78、CHOP、LC3-Ⅱ的表达;
4、RTCA检测细胞增殖;5.Hoechst染色观察细胞核形态。
实验结果:MTT法检测结果显示,顺铂对细胞活性的影响呈剂量依赖性;流式细胞术结果显示,Cisplatin及联合TUDCA、CQ能增加NRK-52E细胞凋亡率;Western blot结果显示,顺铂组凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达高于对照组;RTCA检测结果显示,与对照组的生长曲线相比,顺铂组、TUDCA+顺铂组、CQ+顺铂组的生长曲线明显下降,且TUDCA+顺铂组、CQ+顺铂组下降更明显;Hoechst染色结果显示,顺铂组、TUDCA+顺铂组、CQ+顺铂组,与对照组相比,凋亡核阳性细胞数目明显增加。
实验结论:
1、顺铂致肾小管上皮细胞损伤引发内质网应激、自噬。
2、抑制内质网应激、抑制自噬,明显增加了顺铂对肾小管上皮细胞的损伤,诱导细胞凋亡。
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