NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系的知识与应用！

                  NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系的知识与应用！

一、背景

NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系是由Gazdar AF等在1982年建系而来，源于鳞状细胞肺癌组织；NCI-H520细胞p53 mRNA表达水平较正常肺组织低，但是没有大的结构DNA的异常。NCI-H520细胞角蛋白、波形蛋白阳性，神经丝三联蛋白阴性；NCI-H520细胞在软琼脂中可形成克隆。

二、NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系细胞复苏、传代及冻存流程参考：

1、NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系细胞复苏

1）配制NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。

2、NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系细胞传代

1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系细胞冻存

1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。

三、应用

NCI-H520人肺腺鳞癌贴壁细胞系可以用于左卡尼汀对多西他赛抑制NCI-H520细胞增殖作用影响的研究：

探究心脏保护剂左卡尼汀(L-carnitine,L-CNT)对化疗药物多西他赛(Docetaxel,DTX)抑制肺癌细胞NCI-H520增殖作用的影响,并初步探索L-CNT影响DTX抗肿瘤作用的机制。

方法：

1、实验药物浓度的确定采用MTT法分别测定不同浓度的L-CNT和DTX在24小时对NCI-H520细胞增殖活性的影响,根据MTT的结果确定实验所采用的L-CNT和DTX的作用浓度。其中L-CNT的浓度范围为2.5、10、40、80μg·mL-1,DTX的浓度范围为0.25、2.5、5、10、25、50、100、200μg·mL-1。

2、L-CNT对DTX抑制NCI-H520细胞增殖的影响将NCI-H520细胞分为四组进行实验,分别为对照组(Control)、L-CNT组、DTX组以及联合用药组(L-CNT+DTX)。采用MTT法检测NCI-H520细胞增殖情况,倒置显微镜观察各组细胞形态学变化。

3、L-CNT对DTX诱导NCI-H520细胞凋亡及细胞周期变化的影响采用Annexin V-FITC/PI双染法经流式细胞仪检测NCI-H520细胞凋亡情况,PI单染检测细胞周期。

4、L-CNT影响DTX在NCI-H20细胞中抗肿瘤作用的机制研究。采用Western blot法检测细胞周期相关蛋白p21、p53以及细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。

结果：

1、确定L-CNT和DTX的实验浓度MTT的实验结果显示,L-CNT在2.5-80μg·mL-1浓度范围内,对NCI-H520细胞的增殖无明显影响,各组间的细胞增殖率没有统计学差异。而DTX在0.25-200μg·mL-1浓度范围内,对NCI-H520细胞增殖的抑制表现出明显的浓度依赖性,且随浓度的增加,抑制作用增强。DTX在24h的IC50值为40μg·mL-1。结合临床患者L-CNT用药剂量,确定L-CNT和DTX的实验浓度分别为80μg·mL-1和40μg·mL-1,实验时间为24h。

2、L-CNT能够增强DTX对NCI-H520细胞增殖的抑制作用倒置显微镜下观察结果显示,Control组和L-CNT(80μg·mL-1)组的细胞间连接紧密,细胞轮廓清晰饱满,两组无明显差别,DTX(40μg·mL-1)组细胞出现皱缩、胞质空泡化,细胞间隙变大,L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)组细胞间隙进一步增加,细胞数量减少。MTT结果显示,Control组和L-CNT(80μg·mL-1)组的增殖率无明显变化。与DTX(40μg·mL-1)组相比,L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)组的增殖率由65.73±2.22%下降到54.4±1.67%(P<0.05)。

3、L-CNT通过调节细胞周期增强DTX对NCI-H520细胞增殖的抑制作用细胞凋亡的实验结果显示,在24h,与Control组相比,L-CNT(80μg·mL-1)组、DTX(40μg·mL-1)组和L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)组的凋亡率没有发生明显变化。细胞周期的实验结果显示,与Control组相比,L-CNT(80μg·mL-1)组细胞周期没有发生明显变化。DTX(40μg·mL-1)组细胞发生明显的G2/M期阻滞,G0/G1期细胞比例由70.23±4.5%降低至11.52±0.89%,G2/M期细胞由11.11±2.48%升高至54.91±2.38%,差异均具有统计学意义(P<0.001)。与DTX(40μg·mL-1)组相比,L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)组G0/G1期细胞比例由11.52±0.89%降低至3.98±0.42%,G2/M期细胞比例由54.91±2.38%升高至64.56±0.9%,差异具有统计学意义(P<0.05)。

4、L-CNT能够增高周期相关蛋白的表达与Control组相比,L-CNT(80μg·mL-1)组p21、p53、Bax和Bcl-2在蛋白水平的表达上均无明显差异;DTX(40μg·mL-1)组细胞的周期相关蛋白p21和p53在蛋白的表达水平上有显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2无明显变化。与DTX(40μg·mL-1)组相比,L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)组在周期相关蛋白p21和p53的表达上进一步升高,差异具有统计学意义(P<0.05),凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达并未表现出明显变化。

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