脂肪组织中分离巨噬细胞的实验步骤与注意事项!
一、实验步骤
1、分离
用PBS清洗脂肪组织,并将组织放在冰上的培养皿中,用剪刀将组织切成小块(约3-5mm)。
将切碎的组织转移到含有7mL冰冷消化缓冲液的10mL圆底管中,此操作需一直保持在冰上。对于>1g的脂肪,将组织切碎并转移到含有10mL冰冷消化缓冲液的50mL锥形管中。
加入1mL(如脂肪组织重量>1g则可以增加至1.5mL)10× 胶原酶缓冲液,并加入消化缓冲液使得胶原酶的最终浓度为1mg/mL。
在37°C下孵育半小时,且使试管剧烈摇晃。每10分钟大力摇动试管,可获得更高的细胞产量。30分钟后,取10µL产物进行显微镜观察,此时,脂肪细胞应显示为大的单细胞,白细胞和其他基质细胞会小得多。如果白细胞仍附着在脂肪细胞上,则应继续消化;如果没有,请继续下一步。
消化后,将EDTA添加到10 mM的最终浓度,并在37°C下再孵育10分钟。
2、过滤
用 PBS预湿100 µm尼龙过滤器,然后放置在50mL锥形管上。使用移液管,将前述样本的细胞沉淀先转移到过滤器上过滤,然后再过滤含有脂肪细胞的上层。
加入10 ml FACS 缓冲液轻轻清洗过滤器两次。
3、离心
在4 °C下以500×g 离心10分钟以分离脂肪细胞和巨噬细胞。离心后,脂肪细胞在顶部形成白色层,而巨噬细胞等其它细胞在管底部形成红色或白色沉淀。
轻轻吸出并丢弃脂肪细胞和上清液。此时,含有巨噬细胞的团块很容易受到干扰,因此应格外小心。
4、获取巨噬细胞
通过轻弹试管将沉淀重悬于0.5 mL红细胞裂解液中。在室温下孵育5分钟,偶尔轻轻摇晃。
通过添加5 mL FACS缓冲液,中和红细胞裂解作用。
在4 °C下以500×g 离心10分钟。
在3—5 mL FACS缓冲液中重悬细胞沉淀并在冰上孵育。
5、巨噬细胞计数
将10 µL每个样品1:1与台盼蓝溶液混合。使用血细胞计数板仔细计数活细胞。根据计数得到的细胞数量,结合获得的样本总体积,可计算出每份脂肪组织巨噬细胞产量。典型的产量:瘦小鼠一般为1-3×1000000个细胞/g脂肪,肥胖小鼠一般为2-5×1000000个细胞/g脂肪。
二、注意事项
1、尽可能切碎组织,在消化过程中频繁手动摇动增加接触面积。
2、胶原酶消化脂肪组织时,碎组织大小、摇动强度和孵育时间是关键参数,应对其进行优化,以最大限度地提高从脂肪提取巨噬细胞的产量。
3、胶原酶的消化时间应根据每批胶原酶分别进行优化。增加胶原酶缓冲液中的孵育时间,尤其是超过1小时,会显著降低细胞产量并增加细胞死亡几率。
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