人急性淋巴细胞白血病细胞的应用及培养操作规程！

                 人急性淋巴细胞白血病细胞的应用及培养操作规程！

一、背景

人急性淋巴细胞白血病细胞是人T细胞白血病细胞株CCRF-CEM具有喜树碱抗性的衍生株。1991年细胞株选择并亚克隆了对CPT的抗性。细胞表现出对CPT类似物水溶性的托泊替康和非水溶性的9-氨基-CPT及10,11-亚甲二氧基-CPT具有交叉抗性。CEM/C1细胞对CPT的敏感性较母系CEM细胞低31倍。CEM/C1细胞表现非典型的多药抗性和转换拓补异构酶I催化活性。对CPT的抗性维持6个月以上。

二、人急性淋巴细胞白血病细胞复苏、传代及冻存流程参考

1、人急性淋巴细胞白血病细胞复苏

1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。

2、人急性淋巴细胞白血病细胞传代

1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、人急性淋巴细胞白血病细胞冻存

1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。

三、应用

人急性淋巴细胞白血病细胞可以用于红景天苷增强急性淋巴细胞白血病CEM-C1耐药细胞对地塞米松敏感性的研究：

探讨SAL对人T-ALL细胞系CEM-C7和CEM-C1细胞增值、凋亡和自噬的影响及其是否可以增强GC耐药CEM-C1细胞对地塞米松(Dexamethasone,DEX)的敏感性,为克服白血病细胞耐药提供新的治疗策略。

方法：

1、细胞培养:通过体外细胞培养人T-ALL细胞系CEM-C7和CEM-C1细胞。2.实验分组:

(1)根据SAL的干预浓度(5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0mg/ml、12.5 mg/ml和15.0 mg/ml)将CEM-C7和CEM-C1细胞分别分为5组;

(2)根据DEX的干预浓度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml)将CEM-C7、CEM-C1细胞分别分为5组;以及DEX不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml)联合SAL(1.5 mg/ml)将CEM-C7和CEM-C1细胞分别分为5组;

(3)根据T-ALL细胞系CEM-C7与耐药细胞系CEM-C1是否经SAL优化浓度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5mg/ml、10.0 mg/ml)处理分别分为4组;

(4)CEM-C1细胞根据SAL是否联合DEX分为对照组、SAL组(1.5 mg/ml)、DEX组(100μg/ml)、联合组(DEX 100μg/ml+SAL 1.5mg/ml)。

2、CCK-8(Cell counting kit-8):

(1)检测不同浓度的SAL处理24h、48h、72h后CEM-C7、CEM-C1细胞的增殖活性影响;

(2)检测不同浓度的DEX干预以及不同浓度的DEX联合SAL作用后,各组细胞的增殖活性影响;

(3)同时确定SAL对CEM-C7、CEM-C1细胞的IC50,并计算出耐药倍数、逆转耐药倍数和相对逆转率。

3、细胞凋亡:通过流式细胞仪检测不同浓度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5mg/ml、10.0 mg/ml)SAL干预48h后CEM-C1和CEM-C7细胞凋亡情况;以及SAL是否联合DEX处理CEM-C1细胞后各组细胞凋亡情况。

4、细胞周期:通过流式检测不同浓度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml)SAL干预CEM-C7和CEM-C1细胞48h后周期的改变。

5、实时荧光定量PCR:检测不同浓度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml)SAL干预CEM-C7和CEM-C1细胞48h后后C-MYC和LC3m RNA的表达情况。

6、吖啶橙染色:检测不同浓度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml)SAL干预48h后CEM-C7和CEM-C1细胞自噬的情况。

7、Western Blot:

(1)检测CEM-C7和CEM-C1细胞中C-MYC蛋白的表达变化;

(2)检测不同浓度(0 mg/ml、5.0 mg/ml、7.5 mg/ml、10.0 mg/ml)SAL处理CEM-C7和CEM-C1细胞48h后,自噬蛋白、凋亡蛋白和C-MYC蛋白表达变化;

(3)检测SAL是否联合DEX处理CEM-C1细胞后,各组细胞自噬蛋白、凋亡蛋白和C-MYC蛋白表达情况。

结果：

1、SAL抑制T-ALL细胞增殖:(1)SAL呈剂量依赖方式抑制CEM-C7、CEM-C1细胞增殖;(2)SAL对CEM-C7和CEM-C1细胞的48h IC50分别是8.03mg/ml和6.69 mg/ml。

2、SAL促进T-ALL细胞的凋亡:(1)流式细胞仪检测发现随着SAL浓度的增加,凋亡率显著增加(P<0.001);(2)SAL能诱导细胞凋亡,同时伴有BCL-2蛋白的下调以及Cleaved-PARP蛋白和Bax蛋白的上调(P<0.01);(3)与单用DEX组比较,联合组(SAL+DEX)能够更显著地诱导GC耐药CEM-C1细胞凋亡(P<0.01)。

3、SAL将CEM-C7细胞阻滞于S期(P<0.01),而对CEM-C1细胞周期无影响(P>0.05)。

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