皮肤成纤维细胞的培养和计数,你真的会吗?
成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要组成成分,它是由胚胎时期的间充质细胞分化而来的。
成纤维细胞能够分泌少量的细胞生长因子,也能合成和分泌胶原蛋白和弹性蛋白,生成诸如胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等细胞外基质成分。
成纤维细胞容易培养,取材也非常便利,容易受基因修饰,所以它常常有不同的应用:
1)作为基因修饰的受体细胞应用于细胞核移植、基因表达等方面;
2)作为多种干细胞如胚胎干细胞(ES)和神经干细胞(NSC)等细胞培养的饲养层,其分泌的细胞因子可维持干细胞的未分化状态;
3)可作为研究机体内源性逆转录病毒体外和体内感染性的细胞模型;
4)利用成纤维细胞大量增殖的特性,可用于机体创伤修复包括一般创伤修复和骨创伤修复。
皮肤成纤维细胞培养
1、取材
采集机体皮肤,放入含有双抗(100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)的无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS),反复洗涤多次,剪除毛茬,去除血污、脂肪和结缔组织,保留真皮层,用眼科剪将皮肤剪成3~4mm的碎片。
2、原代培养
a.胰酶消化法:将皮肤组织块用眼科剪剪碎后,加入适量含有0.02%EDTA的0.25%的胰酶进行消化,置于37℃水浴锅内,每隔10min左右吹打摇晃一次,30min后,用100目过滤网滤掉组织块,将细胞悬液1000g离心5min,去除上清液,用培养液重悬细胞,再次离心重悬后,调整细胞密度至1~5×105个/mL,接种于75mL培养瓶内,放入37℃,5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养,每2d换液1次。细胞培养液为含10%胎牛血清(FBS)和1%双抗的DMEM培养液。
b.组织块贴壁培养法:将细碎的组织块接种于75mL培养瓶内,均匀铺于瓶底,皮块之间相距1cm,翻转培养瓶,使瓶底向上,置于37℃,5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养2h,使皮块略微干涸。之后,放正培养瓶,使瓶底向下,加入适量培养液,覆盖瓶底,放入培养箱内进行培养,每2d换液1次,并观察细胞贴壁情况。
3、传代培养
当细胞长到80%~90%汇合度时,开始进行传代培养。吸出培养瓶里的培养液,用已在37℃预热的无钙镁离子的PBS溶液(DPBS)里洗涤3次,去除细胞碎片和残余血清,然后用含0.02%EDTA的0.25%的胰酶在37℃消化2min,观察贴壁细胞变圆时,加入含胎牛血清的培养液终止消化,并用移液器吹打,使细胞脱落,吸取细胞悬液,1000g离心5min,重悬离心2次后,调整细胞密度至1~5×105个/mL,接种于培养瓶内继续培养。
4、细胞冻存
冻存液的配制比例为DMEM: FBS: DMSO=7:2:1。按照传代培养方法对细胞进行消化,离心,去上清液后,用冻存液重悬细胞,调整细胞密度为1~2×106个/mL,取1mL细胞悬液置于1.8mL冻存管内,密封冻存管,并标上细胞类型和冻存时间,将冻存管在4℃冰箱放置30min后,移入-20℃冰箱内1.5h,之后移入-80冰箱内过夜降温,最后将细胞置于液氮内,-196℃长期保存。
5、细胞复苏
将冻存管从液氮中取出,迅速投入到37℃水浴中,并反复摇动冻存管,使之复温,在超净工作台下吸出细胞悬液放入离心管理,1000g离心5min,弃上清,用培养液重悬后,再次离心重悬,调整细胞浓度为1×106个/mL,接种于培养瓶内,置于37℃,5%CO2和饱和湿度的培养箱内进行培养。
Countstar BF在细胞培养过程中的应用
在成纤维细胞培养过程中,不管是原代培养还是传代培养,不管是细胞冻存还是细胞复苏,以及后续的各种细胞实验,对细胞浓度和活率的检测都是最基础的工作,也是后续所有实验的前提。Countstar Mira BF全自动细胞分析仪是一款基于图像法检测,通过采集图像中的细胞信息,进行定量分析,可使用配套的Countstar细胞计数板及标准规格血球计数板对细胞进行自动分析。同时兼容3.5/6/10cm细胞培养皿,T25细胞培养瓶,及4槽或8槽腔室载玻片,对培养过程中的细胞生长状态进行监测分析。
细胞计数
细胞的原代培养,细胞的传代培养,细胞药理性检测,细胞增殖活性检测,细胞杀伤能力检测等各类实验的开展,都要清楚地知道细胞的浓度和细胞的活率,以方便我们更好地进行传代接种、处理样本。Countstar Mira BF利用图像识别原理,可得到如细胞浓度、细胞活率等结果,可同时计数5个样品,每个样品自动采集3-5个视野,保证数据的准确性。
汇合度分析
细胞汇合度是通过细胞占所培养的生长区域内的面积百分比来衡量,细胞汇合度常用来评估细胞的传代时机,及时把握时间,对维持细胞表型和培养质量至关重要。
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