供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 100T/96S |
货号: | BES-2333BTK |
CAS号: |
氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:有毒易挥发试剂,涉及该试剂的步骤建议在通风橱内操作。
2、 试剂五:临用前加入 2.5 mL 蒸馏水,溶解后-20℃分装保存;
3、 试剂六:液体置于试剂瓶内 EP 管中。临用前根据样本量将试剂六、蒸馏水按 1:20(V:V)的比例配制备用,现用现配;
4、 标准品:用 1 mL 蒸馏水溶解,浓度为 10 mg/mL,4℃保存。
产品说明:
氧化型谷胱甘肽(GSSG)是谷胱甘肽(GSH)的氧化形式,又称为二硫代谷胱甘肽,是两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG 会被谷胱甘肽还原酶还原成 GSH,因此机体中大多数是以还原型形式存在。测定细胞内 GSH和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值,能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。本试剂盒利用谷胱甘肽能和 5,5’-二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid,DTNB)反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸,2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长 412nm 处具有最 大光吸收的特点,通过 2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽,然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为 GSH,借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。
技术指标:
最 低检出限:3.211 μg/mL
线性范围:3.9-125 μg/mL
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
分析天平、匀浆器/研钵、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
(1)组织处理
新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次,然后称取动物组织或者植物组织 0.1g。加入用试剂一润洗过的匀浆器中(匀浆器提前放冰上预冷);然后加入 1mL 试剂一(组织/试剂一比例保持不变即可),迅速冰上充分研磨(使用液氮研磨效果更好);8000g,4℃离心 10min;取上清液放置于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。
(2)血液处理
血浆:将收集的抗凝血于 4℃,600g 离心 10 分钟,吸取上层血浆到另一支试管中,加入等体积的试剂一,4℃,8000g离心 10 分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。血细胞:将收集的抗凝血于 4℃,600g 离心 10 分钟,弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次(用 PBS 重悬血细胞,600g 离心 10 分钟),加入等体积试剂一,混匀后 4℃放置 10 分钟,8000g 离心 10 分钟,吸取上清放于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。
(3)细胞处理
收集不少于 500 万个细胞,首先用 PBS 清洗细胞 2 次(PBS 重悬细胞,600g 离心 10 分钟),加入 1mL 试剂一重悬细胞,反复冻融 2-3 次(可在液氮中冻结,37℃水浴中溶解)或者进行超声(200W,超 3s,停 10s,重复 30次),8000g 离心 10 分钟,收集上清于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。
二、测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,分光光度计蒸馏水调零。
2、试剂二放置 37℃(哺乳动物)或 25℃(一般物种)水浴中保温 30min。
3、标准品的稀释:取适当溶液配制浓度为 125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.8125μg/mL、3.90625μg/mL、0μg/mL 的标准品(试剂一十倍稀释后进行稀释)。
4、取 0.5mL 离心管,加入 20μL 稀释好的标准品或样本,加入 1μL 试剂二,混匀后 37℃孵育 30 分钟。
5、制作标准曲线
孵育完成后标准管(0μg/mL 为空白管)依次加入 140μL 试剂三,20μL 试剂四,20μL 试剂五,2μL 试剂六(加入试剂六即开始计时),迅速混匀后,测定 412nm 处 30s 和 150s 光吸收 A1 和 A2,计算 ΔA 标准=A2-A1。以吸光度(ΔA 标准-ΔA 空白)为横坐标(x),浓度为纵坐标(y)做标准曲线。
6、样本管依次加入 140μL 试剂三,20μL 试剂四,20μL 试剂五,2μL 试剂六(加入试剂六即开始计时),迅速混匀后,测定 412nm 处 30s 和 150s 光吸收 A1 和 A2,ΔA 测定= A2-A1。
三、GSSG含量计算
根据标准曲线,将样本(ΔA 测定-ΔA 空白)带入公式中(x),计算出样本浓度 y(μg/mL)。
(1)按蛋白浓度计算
GSSG(μg/mg prot)=y×V 样÷(V 样×Cpr )=y÷Cpr
(2)按样本质量计算
GSSG(μg/g 质量)=y×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=y÷W
(3)按细胞数量计算
GSSG(μg/106 cell)=y×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=y÷细胞数量
(4)按液体体积计算
GSSG(μg/mL)=2y
V 样总:上清液总体积,1mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;W:样本质量,g;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;细胞数量:以 106单位计量;2:血浆(血细胞)稀释一倍。
注意事项:
1、 样本处理需匀浆完全,若当天不能完成测量,可放-80℃保存。
2、 若不确定样本中 GSSG 含量的高低,可稀释几个梯度后再进行测量。
3、 此方法利用酶促反应速率计算底物浓度,尽量准确在 30 秒和 150 秒处完成读数。
4、 如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。
5、 如果样本量过多,可将试剂三与试剂六按照比例混匀配成工作液,在最 后一步加入,加入工作液即开始计时。用多少配多少。
6、 因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂,因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量,需另取组织。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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