供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 100T/96S |
货号: | BES-2305BTK |
CAS号: |
己糖激酶(HK)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1. 试剂二:临用前加入 18 mL 试剂一充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;用不完的试剂 4℃保存一周;
2. 试剂三:临用前取 1 支加入 0.5 mL 试剂一,充分溶解待用;用不完的试剂 4℃保存一周。
产品说明:
HK(EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶,催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH,NADPH在340nm有特征吸收峰。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV板)、研钵/匀浆器、冰。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 在微量石英比色皿或96孔板中加入180μL试剂二、10μL试剂三和10μL样本,混匀,立即记录340nm处20秒时的吸光值A1,比色后迅速将比色皿或酶标板连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴或恒温箱中,准确反应5分钟;迅速取出比色皿并擦干,340nm下比色,记录5分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
三、HK 活性计算
注意事项:
1. 比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
2. 最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
3. 不同匀浆组织中HK 活力不一样,做正式试验之前请做1-2次预试验,若ΔA>0.5,则说明组织活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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