供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/48S |
货号: | BES-2471BTK |
CAS号: |
维生素 A 含量检测试剂盒说明书
高效液相色谱法
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格:50T/48S
产品简介:
维生素 A 是一种脂溶性维生素,具有重要的生理药理作用,是为人体维持正常代谢和机能所必
需的重要营养素。其主要生理功能包括维持上皮组织的完整性,维持各种细胞与细胞器中膜结构的通透和完整性、维持视觉的正常、促进结缔组织中粘多糖的合成等。当机体缺乏维生素 A 时,可能会造成上皮组织增生、角质化。
维生素 A 在一定的光激发条件下具有荧光特性,可利用荧光检测器测定其含量。
试验中所需的仪器和试剂:
高效液相色谱仪(ZORBAX Extend C18 色谱柱(4.6×250 mm),荧光检测器(FLD))、台式
离心机、可调式移液枪、研钵/匀浆器、混匀仪、EP 管、针头式过滤器(有机系)、注射器、抽滤器、滤膜(水系、有机系)、棕色进样瓶、超纯水、甲醇(色谱纯)、乙醚、甲醇(分析纯),无水乙醇。
产品内容:
试剂一:粉剂×2 瓶,4℃避光保存;每瓶临用前加入 10 mL 无水乙醇,充分溶解,4℃避光保
存。
试剂二:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。
标准品:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加入 1 mL 无水乙醇配制成 5 mg/mL 维生素 A 标
准溶液,-20℃密封保存,避免阳光直射。
实验前准备工作:
1. 将甲醇(色谱纯)用有机系滤膜抽滤作为流动相。
2. 将抽滤好的流动相超声 20 min,除去气泡。
4. 标准品的配制:将5 mg/mL的维生素A标准溶液用甲醇分别稀释成200μg/mL、40 μg/mL、8 μg/mL、1.6 μg/mL、0.32 μg/mL 的维生素 A 标准溶液。-20℃避光保存(密封),测试前采用有机系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内,待测。
操作步骤:
一、维生素 A 的提取:
称取约 0.2 g 样本,加入 0.4 mL 的试剂一,再加入 0.2 mL 的试剂二,混匀,密封,80℃水浴中避光放置 30 min,冰上冷却,在通风橱中加入 1 mL 乙醚,震荡混匀约 2 min,静置分层,取上层醚相,再加入 1 mL 乙醚到下层水相中,震荡混匀约 2 min,静置分层,取上层醚相(若醚相仍有颜色可再次加入乙醚萃取),合并醚相。加入 1 mL 蒸馏水到醚相中,震荡洗涤,静置分层去除下层水相(洗至水相约呈中性 pH 是 7(约 3~4 次))。最 后加入少量试剂三到醚相中以除去醚相中残余的极少量水分,取出醚相于通风橱中 40℃水浴挥发醚相至近干(注意:挥发很快,不能挥发至完全干燥),加入甲醇定容至 1 mL,震荡溶解,10000 rpm 离心 10 min,取上清液,测试前采用有机系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内,待测。
二、测定步骤:
1. 开启电脑、打开高效液相色谱仪各模块开关按钮,安装上色谱柱,打开软件,在方法组中设置进样量为 10 μL,柱温 30℃,流速为 0.6 mL/min,荧光检测器:Ex=330 nm,Em=480 nm。单个样本走样时间 12 min,设置完毕保存方法组。
3. 采用相应的流动相清洗柱子,用流动相平衡柱子,待基线稳定后开始加样。
4. 检测待测的标准品溶液,进样量为 10 μL,在 12 min 内可分离出维生素 A,维生素 A 的保留时间约为 7 min(体系、柱子、流动相 pH、温度等不同,保留时间有差异,仅作为参考)。
5. 检测待测的样品溶液,进样量为 10 μL,在相应的保留时间处检测维生素 A 的峰面积。
注意:单个样本测定完成后注意样本物质是否还有残留,必要时可相应延长后运行时间进行色谱柱的清洗。
三、维生素 A 含量计算
以标准品浓度(μg/mL)为横坐标 x,峰面积为纵坐标 y 绘制维生素 A 的标准曲线 y=kx+b,将
样本的峰面积代入标准曲线,计算提取液中维生素 A 的浓度 x(μg/mL)。
维生素 A 的含量(μg/g)= x ×V 提取÷W×F=x÷W×F
V 提取:溶解后样本体积,1 mL;W:样本质量,g;F:稀释倍数,稀释后测试的样本,计算
时需要乘以相应的稀释倍数。
注意事项
1. 测试完毕后,需要用高浓度的超纯水相清洗色谱柱(约 20-30 个柱体积),再用高浓度的有机相冲洗色谱柱,最 后按柱子的种类规范冲洗,防止损伤色谱柱。
2. 标准品的稀释倍数要根据样品中维生素 A 的浓度确定,样品中维生素 A 的浓度必须在标准品溶液的浓度范围之内,该标准品的稀释倍数只是一个参考。若样本中维生素 A 浓度过高,建议稀释后再测。
3. 若样本量过大,建议每天测试一次标准溶液(一个标准溶液即可),以确定相应的保留时间,待测溶液测试前须放置至室温状态。
4. 为了排除溶剂的影响,可进行一次空白对照试验检测。
5. 萃取与洗涤过程中若分层界限不明显需延长静置时间,充分分层。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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