供货周期: | 7天 |
品牌: | 博尔森 |
型号: | 50T/24S |
货号: | BES-2695BTK |
超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(WST-1 法)说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:使用前先离心再吹打混匀,根据样本数量取试剂二,用灭菌水稀释 10 倍后使用。
2、 试剂五:临用前将试剂四加入试剂五中,并震荡溶解。4℃保存 3 个月。
产品说明:
SOD(EC 1.15.1.1)是一种广泛存在于生物体内的金属酶,是重要的氧自由基清除剂,能催化超氧化物阴离子发生岐化作用,生成 H2O2和 O2。SOD 不仅是超氧化物阴离子清除酶,也是 H2O2主要生成酶,在生物抗氧化系统中具有重要作用。
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-),O2-可与 WST-1 反应生成水溶性黄色甲臜,后者在 450nm 处有吸收;SOD 可清除 O2-,从而抑制了甲臜的形成;反应液黄色越深,说明 SOD 活性愈低,反之活性越高。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细菌或培养细胞样本:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)=500-1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2. 组织样本:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3. 血清(浆)样本:直接检测。若有浑浊可离心后取上清进行测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 450nm,蒸馏水调零。
2. 测定前将试剂一、三和五 37℃水浴 5min 以上。
3. 样本测定(在 EP 管中按顺序加入下列试剂)
充分混匀,37℃水浴 30min 后,置于 1mL 玻璃比色皿测定 450nm 下的吸光度,分别记为 A 测定、A 对照、A1空白、A2 空白,计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白。(空白管 1 和空白管 2 各只需做 1~2管,每个样本有一个对照管)
三、 SOD 活性计算
1、抑制百分率的计算:
抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白× 100%
尽量使样本的抑制百分率在 30-70%范围内,越靠近 50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于 30%或大于 70%,则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需适当稀释样本;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需重新准备浓度比较高的待测样本或者提高加样表中的样本量,但需相应减少测定管和对照管中蒸馏水的体积。
2、SOD 酶活性单位:在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为 50%时,反应体系中的 SOD 酶活力定义为一个酶活力单位。
3、SOD 酶活性计算:
(1)血清(浆)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总]÷V 样×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F
(2)组织、细菌或培养细胞 SOD 活力计算:
A 按样本蛋白浓度计算
SOD 活性 (U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总]÷(V 样×Cpr)×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F
B 按样本质量计算
SOD 活性 (U/g 质量)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F
C 按细菌或细胞数量计算
SOD 活力 (U/104 cell)= [抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)×F
=0.0222×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F
V 反总:反应体系总体积,1mL;V 样:加入反应体系中样本的体积,0.09mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万,F:样本稀释倍数。
注意事项:
1、 样本和试剂二使用时在冰上放置。
2、 样本较多时,可按表格配制工作液(包含试剂一、二、三),试剂五必须最后加入。
实验实例:
1、 取 0.1g 三叶草加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清稀释 50 倍,按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定=A测定-A 对照=0.6408-0.0577=0.5831,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.8505-0.0542=0.7963,抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白×100%=26.77%,按样本质量计算酶活得:
SOD 活性 (U/g 质量)=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =2030.6 U/g 质量。
2、 取 0.1g 小鼠肾脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清稀释 50 倍,按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照=0.3921-0.0591=0.3330,ΔA 空白=A1 空白-A2 空白=0.8505-0.0542=0.7963,抑制百分率=(ΔA 空白-ΔA 测定) ÷ΔA 空白× 100% =58.18%,按样本质量计算酶活得:
SOD 活性 (U/g 质量)=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =7728.1 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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