流式样本制备Ⅱ：一学就会！小鼠淋巴结&胸腺单细胞悬液制备全流程

北京层浪生物科技有限公司

2024/09/18 09:40

TA的动态

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Phase.1 实验过程

取淋巴结：

① 颈椎脱臼法处死小鼠（图A）；在解剖台上固定小鼠，从底端四肢剪开皮肤，小心剪开小鼠整个腹部皮肤，暴露出小鼠腹膜（图B）；

② 小鼠淋巴结主要分布在：腹股沟左右两侧（图C）、腋窝（上箭头）和肱（下箭头）淋巴结的位置（图D）；下颌骨（上方箭头）、腋窝（中间箭头）和臂部（底部箭头）淋巴结的位置（图E）；左侧淋巴结位置在图示箭头处（图F），摘取下来淋巴结如图G所示；

③ 将取下的淋巴结置于预冷的PBS中浸泡待用；

研磨制备单细胞：

将淋巴结置于在70μm筛网上，使用研磨棒轻柔碾碎，淋巴结细胞通过筛网过滤至PBS中；淋巴结充分研磨之后，收集筛网下端溶液至50mL 离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；

过滤、洗涤：

通过70μm过滤网过滤，将过滤后的细胞悬液收集至离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；

单细胞计数：

使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL，吸取100μL细胞悬液至流式管中，准备染色。

注意事项：

1.研磨力度尽量轻柔，避免造成过多机械性死亡的细胞；

2.摘取淋巴结后，尽可能移除黏连的脂肪组织，提高淋巴结细胞的占比。

Phase.2 流式结果

小鼠淋巴结中Tfh细胞检测分析

：

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①通过FSC-A/SSC-A圈出淋巴细胞主群（图A.R1）；

②用FCS-A/FCS-H去除粘连体信号，分析单细胞（图A.R2）

③圈出活性的T细胞：LD/B220^-CD3⁺（图A.R3 ），在T细胞中圈出CD3⁺CD4⁺的细胞群（图A.R4）；

④通过共表达高水平的CXCR5和PD1来鉴定Tfh细胞（图B）；

⑤Tfh细胞高表达CD44和CXCR5（图C.左），并且转录因子Bcl6高表达（图C.右）。

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Phase.1 实验过程

取胸腺：

① 颈椎脱臼法处死小鼠，在解剖台上固定小鼠（图A）；小心剪开小鼠整个腹部皮肤，暴露出小鼠腹膜（图B）；

② 切除腹壁；小心地切开隔膜（如箭头所示），而不损伤血管、肝脏或胆囊（图C）；

③ 在不损害血管、肝脏、肺或心脏的情况下切除胸腔，暴露胸腺；胸腺用箭头标记（图D）；

④ 将胸腺置于预冷的PBS中浸泡待用；

研磨制备单细胞：

将胸腺置于在70μm筛网上，使用研磨棒轻柔碾碎，胸腺细胞通过筛网过滤至PBS中；胸腺充分研磨之后，收集筛网下端溶液至50mL 离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；

过滤、洗涤：

通过70μm过滤网过滤，将过滤后的细胞悬液收集至离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；

单细胞计数：

使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL，吸取100μL细胞悬液至流式管中，准备染色。

注意事项：

1.研磨力度尽量轻柔，避免造成过多机械性死亡的细胞；

2.摘取胸腺后，尽可能移除黏连的脂肪组织，提高胸腺细胞的占比；

3.摘取过程中，避免手术器械破坏胸腺附近的血管；若胸腺上有大量血液残留，可用PBS冲洗1-2次后再进行单细胞悬液制备。

Phase.2 流式结果

小鼠胸腺中Treg细胞检测分析

：

undefined ①通过FSC/SSC特性圈出淋巴细胞（G0）(图A)；

②在淋巴细胞群（G0）中，通过FSC-A/FSC-H(图B)和SSC-A/SSC-W（图C）排除粘连体；使用死活染料圈出活细胞群体（G3）（图D）；

③在活细胞中，圈出CD4⁺CD8^-细胞群（图E.G4）；随后展示FOXP3和CD25表达情况，区分两群Treg前体细胞（图F.G5&G6）和Treg细胞（图F.G7）；

④胸腺Treg细胞可分为CD24^highCD69⁺的未成熟细胞（图G.G9）；和CD24^dim/lowCD69^-的成熟细胞（图G.G8）；

⑤CD4SP细胞也可分为CD24^highCD69⁺的未成熟细胞（图H.G10）和CD24^dim/lowCD69^-的成熟细胞（图H.G11）。

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