流式样本制备Ⅰ：跟着步骤走，小鼠脾脏组织单细胞悬液制备so easy！

北京层浪生物科技有限公司

2024/09/18 09:41

流式细胞术做为一种快速的细胞定量分析技术，能够同时对单个细胞进行多种特征参数的检测，如细胞大小、DNA含量、蛋白质表达等，现已成为科研领域中不可或缺的重要工具。

而流式检测能顺利进行的硬要求之一是，样本必须能在鞘液中流动，因此，无论是培养的细胞，还是从各种组织中提取出来的细胞，都需要把待测样本制备成单细胞悬液！制备欠妥的样本，不仅会直接影响实验的准确性和结果的可靠性，一些大的细胞团块甚至会堵塞液流系统而影响仪器的正常运行。

层浪技术宝典第二期，为更好地掌握流式检测的样本制备环节，给大家带来了小鼠淋巴组织单细胞悬液制备的全流程。希望你不管是实验“小白”还是有经验的研究者，都可以能从中受益，轻松搞定实验！

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Phase.1 实验过程

取脾脏：

①颈椎脱臼法处死小鼠（图A）；在解剖台上固定小鼠，从底端小心剪开小鼠整个腹部皮肤，暴露出小鼠腹膜（图B）；

②剪开小鼠腹膜，暴露出脾脏，摘取，并充分去除上面的脂肪组织（图C、图D）；

③将取下的脾脏置于预冷的PBS中浸泡待用。

研磨制备单细胞：

将脾脏置于在70μm筛网上，使用研磨棒轻柔碾碎脾脏组织，脾脏细胞和红细胞通过筛网过滤至PBS中；脾脏充分研磨之后，收集筛网下端溶液至50mL离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；

裂解红细胞：

①在离心后的细胞悬液中加入1mL ACK红细胞裂解液，重悬细胞，在室温裂解5min；

②裂解结束后，加入5mL 含2% FCS的RPMI培养基终止裂解，涡旋混匀；

过滤、洗涤：

通过70μm过滤网过滤，将过滤后的细胞悬液收集至离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；

单细胞计数：

使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL，吸取100μL细胞悬液至流式管中，准备染色。

注意事项：

1.研磨力度尽量轻柔，避免造成过多机械性死亡的细胞；

2.摘取脾脏后，尽可能移除黏连的脂肪组织，提高脾脏细胞的占比；

3.建议使用新鲜配制的红细胞裂解液。

Phase.2 流式结果

小鼠脾脏中Th17细胞检测分析

：

① 通过FSC-H/SSC-H圈出淋巴细胞主群（图A）；

② 通过CD3圈出总的T细胞：CD3⁺（图B）；

③ 通过CD4/CD8圈出杀伤性T细胞（TCL）：CD3⁺CD4^-CD8⁺；辅助性T细胞（Th）：CD3⁺CD4⁺CD8^-（图C）；

④ 在Th细胞群中，进一步圈出Th17细胞：CD3⁺CD4⁺CD8^-IL-17A⁺（图D）。

欢迎关注，下期再会

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