冻存的细胞复苏活率低及细胞冻存注意事项

细胞冻存复苏常见问题

问题一：为什么细胞解冻后缺少活力，活细胞占比较低？

这种现象可能主要由以下几种原因所导致

1.培养物冻存液等质量欠缺

解决方案

a.确保用来制备储存物（冻存液）的起始培养物需要保证其健康、无微生物污染、处于生长对数期后期状态。

b.收获细胞时需要小心翼翼，避免细胞损伤。

2.储存物冻存方法不当

解决方案

a.在liquid nitrogen冷冻细胞时，确保细胞、培养基和其他试剂的浓度，以及冻存实验步骤依照供应商的建议。一般来说，冻存应该缓慢，大约1-3° C/min以减少冰晶形成。

b.使用电子可编程或机械冷冻装置以确保一致的、适当速率的冷冻。

c.选择最合适的细胞冷冻保护剂。如果使用甘油，不要将其存储在光照下，因为曝光会使甘油转化为有对细胞毒性的acrolein。

3.储存物保存不当

解决方案

a.储存物应时刻保持在-130℃，理想情况是置于liquid nitrogen中，以确保较大的细胞活性。

b.如果将细胞直接浸入liquid nitrogen中，容易造成liquid nitrogen泄露到冻存管内，解冻时会有冻存管爆炸的风险。所以一般储存在liquid nitrogen上方的气相环境中。

4.细胞解冻方法不当

解决方案

a.一般来说，细胞应该快速解冻、使用预热的培养基、尽快移除含有冷冻保护剂的培养基防止细胞活力下降。

b.确保小心操作细胞。不要涡旋或高速离心，因为低温保存后的特别容易受到损伤。

问题二：细胞进行解冻或传代后细胞的附着力偏低？

这种情况主要是因为湿度过低致使培养容器上集聚静电所致。

可以通过适当增加房间湿度，使用防静电装置或者用消毒过的湿毛巾擦拭培养容器外侧，来减低静电产生。另外试剂混合不均匀，培养瓶转速等因素也可导致此现象发生。所以在进行细胞培养时，要确保细胞和所有试剂的溶液混合充分。在使用振荡培养箱进行细胞培养时，注意设置适宜的转速。

问题三：为什么细胞复苏后，很多难以贴壁？

忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。

问题四：为什么细胞贴壁了，却长不起来？

此时需要考虑的是细胞密度问题，一些细胞倾向于维持一定的密度，若复苏的细胞生长缓慢，可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。

问题五：收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出liquid nitrogen桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

问题六：冷冻管应如何解冻？

将冷冻管由liquid nitrogen桶中取出解冻时，必须注意安全，可佩戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。

问题七：细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？

现在大多数实验室会在解冻细胞后加培养液将DMSO除去，但也有研究者认为除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有 10~15ml新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

问题八：细胞冻存为什么要添加保护剂？

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，细胞在不加任何保护剂的情况下冷冻，细胞内外的水分会很快形成水晶从而引发一系列的不良反应。

首先，部分蛋白质因局部电解质浓度增高和pH值改变而变性，导致细胞内部空间结构发生改变。

其次，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质，酶的变性等会限碍细胞的能量代谢。再次，胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。

最后，随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间结构发生损伤从而引起细胞死亡。

添加冷冻保护剂可以很好的改善细胞的破坏与死亡情况。

问题九：高效进行细胞冻存应该注意什么？

1.缓慢冷冻：慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因产生大的冰晶而受到损害。相反，细胞内若出现大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

2.细胞活力及浓度：细胞应在生长良好、致密度约为80-90%活力达90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

3.冻存密度：冻存时细胞密度少于5x105个活细胞/mL时，很难成功复苏。

4.冻存管盖子：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

5.冻存时间：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h。

问题十：细胞冻存和复苏的最佳时间是什么时候？

细胞在体外生长期间，通常分为三个阶段：潜伏期、指数生长期和平台期。潜伏期通常是细胞刚刚传代，此时细胞开始贴附基质和伸展骨架，代谢活动集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表达，细胞量在这段时间内几乎没有增加。

随后，细胞开始指数生长期，核酸转录翻译旺盛，DNA解旋、配对频繁，胞内物质传递迅速，细胞数量迅速增长。如果在这个时期冻存，实际上是强行将细胞冻结在代谢的某一时刻，势必造成对解旋的DNA、转录翻译中的RNA和蛋白的机械损伤，增加个环节发生错误的风险。

有著细胞数量的增长，培养容器内，细胞汇合达到90%以上。大部分细胞因为“接触抑制”而停止高速代谢和增殖，胞内活动趋于平缓。所以，建议在刚刚进入平台期时冻存细胞，既可以获得足量的细胞，也不会对细胞造成过多的机械损伤。

问题十一：细胞在liquid nitrogen中可以保存多久？

细胞冻存可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，细胞储存在liquid nitrogen中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。

为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏1次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年复苏1次后，再继续冻存。

问题十二：目前细胞冻存液多采用的什么配方？

目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。

澳睿赛即用型细胞冻存液，直接冻存于-80℃冰箱，长期保存（>5 年），不需要程序性降温，高安全性，病毒、病菌和支原体等污染可能性低，细胞存活率和活力高，批次性差异小。

问题十三：若没有细胞冻存盒，我们该怎么办？

可先将冻存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或过夜，最后放入liquid nitrogen罐内。为了节约时间，还可直接在冻存盒外包裹一团棉花，用棉花代替冻存盒缓慢降温的特点，将细胞转移至-80℃冰箱过夜，再转移至liquid nitrogen保存。

细胞复苏时会有一定的细胞死亡，因此细胞的浓度应足够高，起始浓度106—107个/ml/管。

细胞冻存和复苏需要注意哪些

1.细胞本身的状态

一般情况下细胞的复苏还与原代细胞的活性有关，如果要冻存的细胞悬液本身活性不高的话，后面复苏的存活率也不高。不要在细胞状态不好时，进行细胞冻存。如，长的太过了，培养液已经很黄了；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解;连续培养超过二个月，细胞性状已有改变。应该在增殖旺盛，情况稳定，实验效果良好，复苏后两周内进行细胞冻存。

2.冻存细胞数量要足够

无论你再怎么小心，细胞在冷冻和复苏的时候都是最脆弱的，总会死掉一批。所以，一开始就要保证冻存细胞的数量足够。冻存时细胞浓度低于1-5 ×106个/ml，很难复苏成功，应该离心后调整细胞浓度。

3.慢冻快融

一般情况下，细胞冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。标准的降温速度是1-2℃/min ，当温度到达-25℃，降温速度可加快至5-10℃/min，到-80℃可直接入液氮。有些实验室是梯度冻存：4度，-20，-80，liquid nitrogen，依次冻存。而复苏速度越快越好。从liquid nitrogen罐里取出来之后，迅速放在37°C水浴中，尽快融化

4.注意安全

细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面最容易出事的部分。凡是和liquid nitrogen接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。注意：复苏的时候，在水浴中摇摇动的时候会有爆炸的可能性。另外， DMSO是有毒致癌的。接触的时候一务必要带好手套。

5.做好标记

对于冻存细胞，一定要做好标记。如：细胞名称、代数和冻存日期。特别是公共实验室，更要做好标记，避免找不到自己的细胞。

6.DMSO是否去除

由于DMSO是一种有毒致癌物质。那么，解冻之后，应不应该去除冻存液中的DMSO呢?答案是no。除了极少数特别注明的对DMSO敏感的细胞外，99%的细胞都不需要去除DMSO。后面细胞培养中频繁换液会慢慢去除掉DMSO。

7.尽快转入liquid nitrogen

冻存的细胞应尽快转入liquid nitrogen，不要在-80℃冰箱放置超过一个月。

8.是否需要离心的问题

关于细胞溶解后，是否需要离心的问题，需要根据特定的细胞情况而定。主要有两种方式。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液（后贴壁后即换液）。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程。但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染。另一种是须离心后，将冻存液倒干净，且一定要倒干净。

9.要有耐心

有些细胞复苏后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要换液，耐心等待，两周后再做决定。不要复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。

复苏出现问题，以下 7 点需要自行检查

1.冻存的时候是不是消化的时间过长？太长的消化时间会让细胞复苏时失去贴壁能力，表现为先贴后死，原因是在你复苏的时候细胞已进入凋亡程序，不可逆转的死亡。

2.冻存液好不好？是甘油还是DMSO，质量非常重要，否则也会死亡。

3.你的冻存液的量加的是不是太多？

4.冻存的时候是不是把 DMSO 混均匀?这个有一些影响，但不算太大。

5.你的冻存是否按部就班，就是所温度梯度是不是把握严格?

6.是否是细胞污染？

7.细胞在冻存前是否过密？

以上是澳睿赛生物整理关于冻存的细胞复苏活率低及细胞冻存注意事项。细胞储存在liquid nitrogen中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。在不加任何物质的条件下，直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。若向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞。储存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油。