CAT#:15-96308 低温运输,-20℃保存 | ||||
人免疫球蛋白重链可变区(IgHV)探针法荧光定量PCR试剂盒 | ||||
使用手册V1.0
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产品及特点 | 本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测人免疫球蛋白重链可变区(IgHV)的试剂盒,它具有下列特点: 1. 即开即用,用户只需要提供样品DNA模板。 2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。 3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。 4. 特异性高,引物是根据人免疫球蛋白重链可变区(IgHV)DNA高度保守区设计,不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。 5. 既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。 6. 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。 7. 本产品只能用于科研。 | |||
格及成分 | 成分编号2×Probe qPCR MagicMix190303荧光 PCR 专用模板稀释液180701纯净水100935人免疫球蛋白重链可变区(IgHV)qPCR引物-探针混合液15-96308yp人免疫球蛋白重链可变区(IgHV)qPCR 阳性对照(1×10E7 拷贝/μL)96308pc使用手册15-96308sc
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运输及保存 | 低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。 | |||
自备试剂 | 样品DNA。 | |||
使用方法 | 一、稀释标准曲线样品(以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。 1. 标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2,1。 2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同。 3. 在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 4. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 5. 换枪头,在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。 6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。 二、样品DNA的制备 7. 如果有N个样品待提取,最好设置N+2个提取,多出的是PC(样品制备阳性对照)和NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为PC。另外用水作为NC。 8. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。 三、Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行) 9. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加): 成分/每管样品管N+2个PCR阴性对照管标准曲线样品管(1-6管)2×Probe qPCR MagicMix10 μL10 μL10 μLqPCR引物-探针混合液3 μL3 μL3 μL N+2个待测DNA模板7 μL--纯净水-7 μL-第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)--7 μL(1号样到1号管,2号样到2号管…)11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR: 过程温度时间预变性95℃10 minPCR反应(45个循环)95℃15 sec60℃60 sec(采集FAM通道的荧光信号)四、数据处理 12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的log值,再推算出其浓度。 13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于39。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于39则为阳性。如果在39-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。 | |||
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