供货周期: | 14天 |
品牌: | 雅吉生物 |
规格: | 1盒 |
型号: | 50次/盒 |
货号: | 1581600 |
有效期: | 12月 |
标准值: | 详见说明 |
本产品仅供科研
更多产品详细信息可免费向客服索取
产品名称:Naegleria spp.纳氏虫属·探针法荧光定量PCR试剂盒
1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. 特异性高,不会跟其他微生物的 DNA 发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研。
包装规格及成分(具体信息详见说明书):
探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | |
探针法qRT-PCR酶混合液 | 50μL | |
荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL | |
PCR引物-探针干粉 | 50T | |
PCR阳性对照(107拷贝/μL) | 50μL |
Naegleria spp.纳氏虫属·探针法荧光定量PCR试剂盒操作过程:
一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10E6 拷贝/μL 这6 个10 倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同。
3. 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
1. 如果有 N 个样品待提取,最好设置 N+2 个提取,多出的是PC(样品制备阳性对照)和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL 再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为 PC。另外用水作为 NC。
2. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
如果进行定量分析,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线样品。如果做定性分析,则6个标准曲线样品只选一个做(可以选4号,其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。
四、数据处理
1. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log 值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上
推算出样品核酸浓度的 log 值,再推算出其浓度。
2. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲
线,Ct 值应该小于或等于 39。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于40 则为阴性,如果小于或等于 39 则为阳性。如果在 39-40 之间,
则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。
成分 | 样品管N+2个 | RT-PCR阴性对照管 | 标准曲线样品管 (2-7 管) |
探针法qPCR缓冲液 | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
探针法 qPCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
qRT-PCR探针 | 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
探针qRT-PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
待测样品 RNA 模板 | 各 5 μL | -- | -- |
超纯水 | -- | 5 μL | -- |
第 7 步所得标准曲线样品稀释液(2-7 号) | -- | -- | 各5 μL(2号样到2号管,3号样到3 号管…) |
盖上盖子后上机,按下面参数进行 qRT-PCR:
过程 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 50℃ | 30 min |
预变性 | 94℃ | 10 min |
qRT-PCR 反应(40 个循环) | 94℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min(采集 FAM 通道的荧光信号) |
保存条件:-20℃
保质期:12个月
Naegleria spp.纳氏虫属·探针法荧光定量PCR试剂盒检测方法的局限性
A.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
B.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
C.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
D.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
E.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
F.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
Naegleria spp.纳氏虫属·探针法荧光定量PCR试剂盒注意事项
1操作严格按照说明书进行;
2试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完全混匀并短暂离心;
3反应液应避光保存;
4反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
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