人淋巴母细胞（EBV 转化）(NCI-BL2009)

细胞名称：人淋巴母细胞（EBV 转化）(NCI-BL2009)

细胞规格：1X10^6（需加干冰运输费）

细胞冻存：无血清冻存液

细胞传代：第一次建议1:2

种属来源：人

组织来源：血液

人淋巴母细胞（EBV 转化）(NCI-BL2009)操作步骤

1、您收到细胞后，请按照以下方法进行操作：

取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

2、细胞传代

1) 常规细胞长至 80%-90%汇合度即可传代。在超净台内把培养瓶里的培养液倒至废液缸，用1×PBS（T25 cm2培养瓶添加约 2~3mL，T75 cm2培养瓶约 4~5 mL）洗涤细胞1~2次，以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；

2) 加入相应体积的胰酶溶液，具体参考附表 1，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 1~2 分钟（若细胞难以消化，可适当延长孵育时间），待在显微镜下观察到大部分细胞变圆不贴壁，轻轻晃动和敲击培养瓶两侧有大量细胞立即终止消化；

3) 加入 2 倍胰酶体积的完全培养液终止消化，并轻吹打细胞数次，使所有细胞彻底脱壁；（注意：吹散细胞时注意要轻柔，尽量不产生气泡或尽可能产生少量气泡。）；

4) 用 10 mL 移液管转移细胞悬液到一支 50 mL 离心管中，同一批次的细胞可以合并收集在一起，视情况用适量 PBS 将培养瓶里的残余细胞洗下来，一起加到 50mL 离心管中。盖上盖子，做好标记；

5) 1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心后，打开盖子弃上清，加 2mL 完全培养基重悬细胞；6) 细胞按照一定的接种比例传代，首次按照 1：3 进行传代，若细胞在两天内长满可增加传代比例，若细胞生长三四天还未长满，可适当缩小传代比例。

3、细胞冻存：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%Y蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9 ：1）重悬细胞，并放置于冻存管中；

4）先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。

4、细胞复苏

1) 准备工作：将完全培养液置 37℃水浴锅预热 30 分钟，随后将冻存的细胞从液氮中取出，转移到-80℃冰箱，放置数分钟让残余液氮挥发；

2) 在超净台内用吸管吸取 6-7 mL 完全培养液至 15 mL 离心管中；

3) 将细胞从-80℃冰箱取出暂时放置于干冰里，复苏时稍稍甩动，去除残留的干冰和液氮，再迅速用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化；

4) 在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，稍稍晾干。用单道移液器将所有融化的细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，盖上盖子，1100 rpm 室温离心4 分钟收集细胞；5) 超净台内小心吸弃上清，用单道移液器吸取 1 mL 新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移至装有 4 mL 完全培养液的 T25 cm2培养瓶 (或者 6cm 的皿) 中，写上细胞名称、复苏日期、代次，放置 37℃、5% CO2 饱和湿度培养箱内培养。

1、倍增和代数有什么区别？倍增是培养物中细胞总数加倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。

2、接收到的冻存细胞该如何处理？收到包装箱后，立即将冻存细胞从干冰移入液氮中冻存。此过程尽量快以避免升温。不要将细胞储存在-80℃，这样会对细胞造成不可挽回的伤害。

3、有多少经验才能开始正常人类细胞培养？推荐有经验者在无菌环境下用层流净化罩工作，如果有经验的话对其它细胞类型也是很有利的。如果你是细胞培养的初学者或打算建立细胞培养实验室，我们会为你提供帮助。请的细胞培养专家。

人淋巴母细胞（EBV 转化）(NCI-BL2009)售后服务告知书

1）细胞出现问题，可重发的情况有哪些？判定标准是什么？

1. 细胞运输途中遭遇的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，重发；

2. 细胞污染问题，请在收到产品48小时内，给我们提出真实的实验结果，核实后重发；

3. 常温发货的细胞静置24小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后24小时后，绝大多数细胞未存活，（需提供真实清晰的细胞状态照片）重发

4. 干冰冻存发货的细胞复苏后24小时后或常温发货的细胞静置4小时候并且未开封，出现污染，重发；

5. 细胞活性问题，请在收到产品7天内给我们提出真实的实验结果，用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予重发；

6. 细胞收到当天以及第2,3天请拍照，3天未告知的，视为产品合格。4-7天内出现问题有提供收到细胞前3天照片和细胞出现问题时照片以及细胞相关操作的详细步骤的并跟技术人员沟通的，由技术人员判定为我方责任的，重发。技术人员判定为双方承担责任的由双方进行协商处理或者按合同价的50%收费重发。

二）细胞出现问题，不予以重发的情况有哪些？

1. 客户造成细胞污染，不重发；

2. 客户不正确操作致细胞状态不好，不重发；

3. 非本库推荐细胞培养体系致的细胞状态不好，不重发；

4. 细胞状态不好，未提供细胞培养前3天照片的，不重发；

5. 细胞培养时经其它处理的，不重发；

6. 细胞收到2天内，未告知，不重发；

7. 视具体情况而定。