多快好省| Vanquish Duo系统助力mRNA疫苗药物方法开发

赛默飞色谱与质谱

2024/06/05 14:43

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杨艳冉良骥

mRNA疫苗or药物

mRNA药物按用途和药物类型主要分为三大类：预防性疫苗、治疗性疫苗和治疗性药物[1]。mRNA疫苗主要有两种结构，分别为传统非复制mRNA和自复制mRNA[2]，结构见图1。传统非复制mRNA包括5’加帽（5’cap）、5’非翻译区（5’UTR）、开放阅读区（ORF）、3’非翻译区（3’UTR）和poly（A）尾部结构；其中自复制mRNA可以通过位于5’UTR下游嵌入的复制区（图1橙色部分）进行自我复制，增加靶蛋白表达，进而减少所需剂量30-1000倍。2023年11月27日，日本厚生劳动省批准了CSL与Arcturus therapeutics联合开发的一款自复制RNA(saRNA)新冠疫苗：ARCT-154，用于18岁及以上成人初次接种和加强接种。ARCT-154成为全球首款获批上市的自复制RNA疫苗。saRNA疫苗以极低剂量便可触发高效免疫反应，成为下一代RNA疫苗的率先破局者。

图1.mRNA疫苗结构[2]（上为传统非复制mRNA，下为自复制mRNA）（点击查看大图）

据市场分析[1]：mRNA药物的市场规模短期取决于COVID-19疫苗的销售，但是随着其他预防性疫苗和治疗性疫苗产品的推出，mRNA药物市场预计从2028年开始增长，2035年将达到230亿美元。其中预防性疫苗市场份额超50%，治疗性疫苗约占30%，治疗性药物占比不到20%。2023年至2024年5月，NMPA共受理了5款mRNA的预防性疫苗，其中4款是2024年获批临床试验。

mRNA的纯度检测非常重要，某些杂质可能引起免疫原性、减少mRNA翻译为蛋白。通过液相色谱仪结合不同分离机理的色谱柱进行mRNA纯度检测是常用、稳定且快速的手段，但不同模式下，流动相和色谱柱差别较大，如何快速开发最适合的色谱条件是分析人员面临的一大挑战。

为了解决这一难题，我们利用Vanquish Duo液相色谱配合自动方法开发套件，同时优化了三种模式（反相模式、离子交换模式、体积排阻模式）下mRNA的液相色谱纯度测定方法。借助自动方法开发套件中的两个10位11 通阀，可以大幅提高液相色谱可选的溶剂通道数量，无需手动更换流动相，即可在短时间内自动切换多种色谱条件，助您选出最合适的分离方法。借助Vanquish Duo双通道液相模式，更可以节能增效，通过完全独立的流路设计（参见图2），可在0交叉污染的前提下，同时实现两种不同分离模式的方法优化。

图2. Vanquish Duo双通道液相色谱仪流路图

（独立流路1：编号1-3-5-7；独立流路2：编号2-4-6-8）（点击查看大图）

三种分离模式表征结果

1. 2500 nt的mRNA[3]和12000 nt的自复制mRNA反相色谱开发结果

实验测试不同pH的25 mM己胺（HAA）、100 mM 三乙胺（TEAA）、25 mM二异丙基乙胺（DIPEA）体系流动相对2500 nt的mRNA纯度分离的影响，反相色谱柱DNAPac RP（4 μm 2.1*100 mm），发现pH8.5的25 mM HAA对该mRNA样品分离效果最好，见图3。

图3. 2500 nt的mRNA在pH8.5的25 mM HAA体系下的色谱图（点击查看大图）

实验测试不同pH的25 mM HAA、100 mM TEAA、25 mM DIPEA体系流动相对12000 nt的mRNA纯度分离的影响，反相色谱柱DNAPac RP（4 μm 2.1*100 mm），在pH8.5的100 mM TEAA体系下，该mRNA样品分离效果最好，见图4。

图4. 12000 nt的自复制mRNA在pH8.5的25 mM HAA体系下的色谱图（点击查看大图）

2. 2500 nt的mRNA离子交换色谱开发结果[3]

采用Tris和氯化钠、tris和高氯酸钠、氢氧化钠和氯化钠、氢氧化钠和高氯酸钠体系及上述体系分别加10%乙腈，按照正交实验设计，测试不同盐体系和柱温对2500 nt的mRNA样品的分离情况，离子交换色谱DNAPac PA200 RS （4 μm 4.6*150 mm），最佳分离该样品的流动相组合：流动相A为40 mM Tris pH9、流动相B为40 mM Tris，0.8 M 高氯酸钠，20%乙腈， pH9，柱温80℃，样品谱图见图5。

图5. 2500 nt的mRNA在tris、高氯酸钠体系下的色谱图

（点击查看大图）

3. 12000 nt的自复制mRNA的SEC液相色谱结果

对12000 nt的自复制mRNA进行SEC液相色谱开发，使用孔径2000Å的SEC色谱柱（5 μm 7.8*300 mm），在pH7的100 mM磷酸盐条件下等度分析，该样品的聚体、主峰和片段具有较好的分离，见图6。

图6. 12000 nt的自复制mRNA的SEC色谱图

（点击查看大图）

结论

利用Vanquish Duo双通道液相色谱系统可以快速地进行不同碱基数量的mRNA样品纯度分析，在双液相分析模式下，借助0交叉污染的双流路，可以同时开展反相模式、离子交换模式、SEC模式的方法优化，达到节能增效的目的。除了双液相分析模式之外， Vanquish Duo平台双通道液相还可以通过串联模式提高梯度分析过程中质谱的利用效率；通过反梯度补偿进一步提高CAD电雾式检测器待测物质的响应一致性。相关应用可以参考文末链接。