蛋白活定仪

阐明小分子（包括内源性代谢物和外源性化合物）如何发挥调控作用的关键问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互作用研究。蛋白质与小分子的相互作用模式既有较稳定的共价结合，也有瞬时的弱相互作用。如何灵敏、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互作用是分析难点。目前，蛋白质-小分子相互作用的分析策略大致可分为两类：一是靶向相互作用研究，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互作用的小分子（或蛋白质）；二是非靶向相互作用研究，全面识别多种蛋白质-小分子的相互作用轮廓。应用的具有分析技术包括：表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱分析技术（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱分析技术（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热迁移分析技术（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反应靶标稳定性分析技术（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）的原理、技术流程和其在蛋白质-小分子相互作用研究中的应用。1. 原理LiP-MS技术最初由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组建立 [1] ：利用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的变化，经蛋白酶切后形成差异肽段，液质联用分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段推测蛋白质与小分子的相互作用位点。2. 技术流程在非变性条件下提取蛋白，以保留蛋白活性和空间结构。先使用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互作用位点存在空间位阻，从而避免被蛋白酶K切割，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段所处位置预测蛋白质与小分子的相互作用位点（图1）。图1 限制性蛋白水解-质谱分析（LiP-MS）技术流程 [2]3. 试验试剂和分析仪器3.1 蛋白抽提：可依据实际目的和细胞类型选择不同的细胞/组织裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/组织蛋白抽提，获得的细胞/组织全蛋白提取物可直接与目标小分子共孵育。3.2 蛋白酶切：关键的蛋白酶切试剂，例如蛋白酶K、胰酶等均有市售。3.3 分析仪器：目前多种类型的液相色谱-高分辨质谱联用仪均可用于蛋白质组学分析，已应用于LiP-MS的高分辨质谱仪包括，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。4. 应用实例研究人员基于LiP-MS技术在大肠杆菌中探索多种内源性代谢物和蛋白的相互作用模式 [1]，先采用凝胶过滤法除去大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，获得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）分别共孵育。基于LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白发生潜在相互作用，其中1447个相互作用是首次发现的（图2B）。作者将所发现的相互作用与在线数据库BRENDA对比（主要涉及酶的功能和代谢通路等信息），证明LiP-MS技术能够准确地识别已报道的蛋白-内源性代谢物相互作用，假阳性率低于6 %。图2 20个与中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（图A）及其在大肠杆菌中发生相互作用的蛋白数量（图B）[1]参考文献：[1] Piazza, I., Kochanowski, K., Cappelletti, V., Fuhrer, T.,Noor, E., Sauer, U., Picotti, P. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of chemical communication. Cell, 2018, 172(1-2), 358-372.[2] Pepelnjak M, Souza N D, Picotti P. Detecting Protein–Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis–Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends in Biochemical Sciences, 2020, 45(10), 919-920.

产品名称 制造商名称 进口商名称 重量（吨） 不合格原因描述 处理措施 进境口岸 美赞臣婴儿配方奶粉（9-24个月） Mead Johnson & Compy 厦门中马进出口有限公司 0.116 蛋白质含量不符合国家标准 退货 厦门 美赞臣婴儿配方奶粉（0-12个月） Mead Johnson & Compy 厦门中马进出口有限公司 0.184 蛋白质含量不符合国家标准 退货 厦门 丸三牌调制豆奶 丸三株式会社 上海心征商贸有限公司 0.906 标签不合格 销毁 上海 丸三牌调制豆奶 丸三株式会社 上海心征商贸有限公司 0.906 标签不合格 销毁 上海 丸三牌豆奶饮料麦芽咖啡 丸三株式会社 上海心征商贸有限公司 0.186 标签不合格 销毁 上海 脱盐乳清粉 JAMES FARRELL AND CO 上海锦江国际贸易有限公司 158 检出过氧化苯甲酰 退货 上海 甜乳清粉 OLAM INTERNATIONAL LIMITED 中轻日用百货进出口公司 132 检出过氧化苯甲酰 退货 上海 甜乳清粉 OLAM INTERNATIONAL LIMITED 中轻日用百货进出口公司 100 检出过氧化苯甲酰 退货 上海

p style=" text-indent: 2em " NOD 样受体蛋白 3（NLRP3）可检测微生物感染或内源性危险信号并激活 NLRP3 炎性小体，后者在宿主防御中具有重要功能，并有助于炎症性疾病的发病，因此需要严格控制。NLRP3 的去泛素化被认为是 NLRP3 炎性小体激活的关键步骤。但是，去泛素化控制 NLRP3 炎症小体激活的机制尚不清楚。 br/ /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 2020 年 11 月 27 日，山东大学赵伟团队在& nbsp Nature Communications& nbsp 在线发表题为& nbsp UAF1 deubiquitinase complexes facilitate NLRP3 inflammasome activation by promoting NLRP3 expression& nbsp 的研究论文，该研究显示& nbsp UAF1 / USP1 去泛素酶复合物选择性去除 NLRP3 的 K48 连接的多泛素化并抑制其泛素介导的降解，增强细胞 NLRP3 的水平，这对于随后的 NLRP3 炎症小体组装和激活是必不可少的。 /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 此外，UAF1 / USP12 和 UAF1 / USP46 复合物通过抑制泛素化介导的 p65 降解来促进 NF-κB 活化，增强 NLRP3 和促炎细胞因子（包括促 IL-1β，TNF 和 IL-6）的转录。 /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 因此，在体外和体内，Uaf1 缺乏都会减弱 NLRP3 炎性小体激活和 IL-1β 分泌。该研究表明，UAF1 去泛素酶复合物通过靶向 NLRP3 和 p65 并导致 NLRP3 炎性体激活来增强 NLRP3 和 pro-IL-1β 的表达。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 518px height: 322px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/97977483-8da6-4393-ad9b-b20ed4d59589.jpg" title=" 微信图片_20201204192638.jpg" alt=" 微信图片_20201204192638.jpg" width=" 518" height=" 322" / /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " NLRP3 炎性小体是一种多分子复合物，包含 NOD 样受体 NLRP3，ASC 和效应蛋白 caspase-1。NLRP3 炎性体识别来自入侵的微生物的病原体相关分子模式（PAMP）和从受损或垂死的细胞中释放的内源性危险信号（损伤相关分子模式 DAMP）。NLRP3 在接收到来自通 TLR 的启动信号和来自各个 NLRP3 炎性小体激活剂（例如细胞外 ATP，尼日利亚霉素，β- 淀粉样蛋白等& nbsp ）的激活信号后，与 ASC 和 procaspase-1 组装了炎性小体复合物。 /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " NLRP3 炎性小体复合物随后充当半胱氨酸蛋白酶 caspase-1 的自我切割和活化的成分，促进 IL-1β 和 IL-18 的成熟和分泌，并诱导焦磷酸化。异常的 NLRP3 炎症小体激活与多种疾病有关，例如传染病，痛风，2 型糖尿病，动脉粥样硬化，阿尔茨海默氏病和癌症。因此，应严格调节 NLRP3 炎性小体的活性，以避免此类疾病。 /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 泛素化是控制 NLRP3 炎性小体活化的关键翻译后修饰（PTM）。在静止的巨噬细胞中，NLRP3 被混合的 K48 和 K63 泛素链多聚泛素化，这对于维持 NLRP3 失活至关重要。NLRP3 在引发和激活后会去泛素化，这是 NLRP3 炎性体形成和激活的关键步骤。ABRO1 募集 BRCC3 来去除 NLRP3 的 K63 泛素化，从而促进 NLRP3 炎性小体的组装和激活。K48 连接的泛素化介导 NLRP3 的蛋白质降解，因此限制了 NLRP3 炎性体的激活。 /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 尽管已报道了几种 E3 泛素连接酶，例如 TRIM31，March7，ARIH2 和 FBXL29 通过介导 NLRP3 蛋白降解来减弱 NLRP3 炎性小体活化，但 K48 连接的去泛素化对 NLRP3 炎性小体活性的功能仍不清楚。是否存在任何去泛素化酶以特异性去除 NLRP3 的 K48 连接的泛素化，稳定其表达并因此获得 NLRP3 炎性体激活的许可，仍有待研究。 /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 泛素特异性肽酶 1（USP1）相关因子 1（UAF1，也称为 WDR48 或 p80）是三种去泛素化酶的结合伴侣，并构成了三种去泛素化酶复合物，包括 UAF1 / USP1，UAF1 / USP12 和 UAF1 / USP46。UAF1 与 USP1，USP12 和 USP46 组成性结合，这种结合极大地增强了它们的去泛素酶活性。UAF1 / USP1 复合物可泛素化多种底物，并已参与 DNA 修复过程的调控，肿瘤发病机制和抗病毒先天免疫。& nbsp /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " USP1 可以去泛素化并稳定 DNA 结合蛋白（IDs）的抑制剂，并随后促进骨肉瘤中间充质干细胞的维持。USP12 和 USP46 还通过去泛素化和稳定不同的靶标而参与肿瘤的发病过程，这些靶标包括 PH 结构域富含亮氨酸的重复蛋白磷酸酶 1（PHLPP1），TP53 和雄激素受体（AR）。但是，UAF1 去泛素酶复合物在炎症中的潜在作用尚不清楚。 /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 在这里，该研究显示 UAF1 通过招募去泛素化酶 USP1，USP12 和 USP46 来促进 NLRP3 炎性体激活。UAF1 / USP1 复合物与 NLRP3 相互作用，去除其 K48 连接的多聚泛素化，并稳定 NLRP3 蛋白。UAF1 / USP12 和 UAF1 / USP46 复合物与 p65 相互作用并抑制其泛素化和降解，促进 NF-κB 活化，从而导致 NLRP3 和 pro-IL-1β 表达增强。因此，UAF1 去泛素酶复合物通过靶向 NLRP3 和 p65 促进 NLRP3 炎性体的激活。 /p p br/ /p p style=" text-indent: 2em " 总之，该研究揭示了调节 NLRP3 炎性小体激活的机制，并提出了一种有前途的调节 NLRP3 依赖性免疫病理学的方法。 /p p br/ /p