临床快速仪

[align=center]基于高分辨质谱技术的中毒毒物快速分析与临床实践[/align]毒物是一个比较宽泛的概念，任何以较低的剂量就可以致人畜死亡的物质均可以认为是毒物，而毒物的概念也具有相对性，对于一个物质是有毒还是无毒的判定有一系列的先决条件，不存在任何条件下都无毒或者绝对有毒的物质。其中农药占比9.46%，药物占比21.07%， 化学物如乙醇、CO占比62.85%。在今天，毒物致死是继恶性肿瘤、脑血管疾病、心脏病和呼吸系统疾病后的第五大死亡原因，其中毒机制主要有：干扰酶的活性、破坏细胞膜的功能、阻碍氧的吸收、输送和利用、损害免疫功能等。毒物致死问题亟待解决，毒物的快速分析检测和临床实践刻不容缓。在我国，中毒患者的诊断现状缺乏快速有效准确的检测手段。对急性中毒患者误诊、治疗耽搁的不合理选择和使用等会对患者造成不同程度的伤害，且检测无法覆盖多种目标化合物，同时难以定量检测。因此发生了诸多事件，如清华大学朱令事件、扬州大学秋水仙碱投毒事件等。因此，中毒物质检测技术亟待更新。准确及时的毒物检测与诊断直接影响临床治疗方案的选择，在临床抢救治疗过程中发挥着至关重要的作用。毒物检测方法的发展历程：自薄层层析法、化学法，发展至今现代仪器分析法，一道道技术难题被攻克，鉴定毒物越来越准确。毒物分析仍面临一系列挑战，毒物及其代谢产物在体内浓度极低，常规检测手段难以达到检测所需的灵敏度，存在检出假阳性的可能；代谢产物与原型毒物结构相似，造成对检测的干扰；生物基质复杂，可能会有干扰；毒物种类繁多，理化性质差别大，且中毒时限紧迫，检测需要快速高效。近年来，色谱质谱技术在毒物分析中逐渐应用起来，色谱法凭借其分离效率高、选择性好和灵敏度较高的优点，已广泛应用于中毒物质检测，但中毒患者毒物复杂，仅靠被测物质的保留时间和光谱吸收或电化学检测无法准确定性定量，且耗时长，鉴定效率低。质谱联用法弥补了色谱法的缺点，凭借其灵敏度超高（可达飞克）对极微量物质进行定量分析，质谱法特异性高，其SRM和MRM模式选择性高，且高通量，检测范围覆盖绝大多数化合物，但三重四级杆对未知毒物的定性能力相对较差。而高分辨质谱可以弥补上述的缺点，其优势体现在超高分辨率和准确度，可在复杂基质样本中保证目标质荷比的准确测定，进而排除假阳性结果；其优势还体现在强大的同时定性定量能力，快速实时正负切换，同时获得一级高分辨数据和完整的二级碎片离子信息。中毒毒物质谱分析和处理方案主要流程：样品收集；样品前处理；高分辨率和高灵敏度的高分辨质谱同时定性定量分析；针对未知的中毒毒物可进行毒物筛查与鉴定；针对已知的中毒药物，可进一步确定中毒药物体液浓度，并设定安全范围，在安全范围内的病人对症抢救。在超安全范围的病人对因抢救。有两个案例与大家分享，案例一：患者孙某，51岁男，诊断其为肝硬化失代偿期，肾病，银屑病，经过针对性治疗后，症状得到有效控制，但间断出现无法解释的血液（白细胞，血小板）指标异常、脱发、昏迷等。在组织多科室，多学科会诊后，仍不能解释上述病症，经询问，患者近期服用一种成分不明的药物，白色小瓶中黄色药片，考虑到患者银屑病的病史，遂即诊断为药物中毒。实验室采用高分辨质谱仪对样品进行分析，经碎片裂解规律推导和对照品比对，在两个小时内明确了患者是因为服用了甲氨蝶呤过量而导致的药物中毒。案例二：患者刘某，45岁男，误服用百草枯60 mL导致双肺纤维化，临床诊断为百草枯中毒、双肺纤维化和肾功能不全。临床治疗采用序贯式双肺移植术，先左后右的顺序，采用高分辨质谱对移植前患者体内百草枯体内快速定性定量，12小时内开发出百草枯的定性定量方法，并给出了分析报告，随后至今患者移植物功能稳定。高分辨质谱技术在中毒毒物快速分析与临床实践还会有更多实用案例。感谢郑州大学孙晓坚和孙志研究团队！

1. 临床常见细菌的鉴定：2009年Seng等用1660株细菌对MALDI-TOF MS常规鉴定细菌进行前瞻性研究，结果显示MALDI-TOF MS是一种经济、快速、准确的常规细菌鉴定方法，未来有可能取代传统的革兰染色和生化方法。此后，MALDI-TOF MS在临床应用迅速增加。在Medline数据库用“MALDI tof bacteria identification”作为MeSH检索词，从2009至2013年1月发表相关文章467篇，其中2011至2013年发表323篇。由此可见MALDI-TOF MS近几年在临床微生物检验中备受关注。　　另外，MALDI-TOF MS对弯曲菌、螺杆菌、军团菌等苛氧菌、少见菌等的鉴定，解决了微生物实验室对这类病原菌的鉴定、临床对其感染的诊断和治疗、流行病学资料缺失等的瓶颈问题。　　2. 样本直接检测：应用MALDI-TOF MS直接鉴定阳性血培养标本中的细菌和真菌可以极大地提高检测速度。大量的研究尝试用不同的方法来处理血标本，由于血培养基各异、数据库和分析软件等差异都对样本前处理的方法标准化造成了一定的困难。布鲁克公司研发了血培养标本的前处理试剂盒，用于阳性血培养标本直接质谱鉴定的前处理。研究显示革兰阴性菌的准确率优于革兰阳性菌，而对厌氧菌、α-溶血性链球菌和多个细菌混合样本的鉴定存在困难。新的富集技术的应用（比如附加特异性抗体亲和特定蛋白）以及相应分析软件的改进，将使MALDI-TOF MS直接用于血液病原菌的检验成为可能，即MALDI-TOF MS作为一种快速、使用简便，低成本消耗的检测技术，有望取代传统血培养检测技术，为血培养中病原菌的快速诊断提供有力支持。此外，临床的尿液和脑脊液标本也可以经一定处理后，用质谱技术进行蛋白谱的分析用于疾病的辅助诊断。　　3. 真菌鉴定：有学者应用MALDI-TOF MS对327株菌（其中19株为酵母菌）在种的水平上鉴定正确率为61株为酵母菌）的鉴定正确率为92%。　　4. 非结核分枝杆菌鉴定：国外学者对107株分枝杆菌临床分离株（包括结核分枝杆菌复合体），利用声波降解的热失活方法和利用玻璃珠进行细胞裂解的方法进行失活和提取，再利用MALDI-TOF MS方法进行鉴定，发现两种方法在种/属水平上成功鉴定率分别为82.2%和88.8%。周昭彦等采用MALDI-TOF MS对83株非结核分枝杆菌（临床分离非结核分枝杆菌15株和医院供水系统环境分离非结核分枝杆菌68株）进行快速鉴定方法及其可行性、准确性和重复性进行研究，并得出结论认为MALDI-TOF MS可快速准确地鉴定临床和环境分离的非结核分枝杆菌，在临床实验室常规鉴定方面有着较好的应用前景。　　5. 质谱技术检测病原菌耐药性：除快速鉴定外，质谱技术也被尝试用于检测一些临床常见的耐药基因，例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、万古霉素耐药的肠球菌等的识别，鲍曼不动杆菌相关的耐药机制与产生条件等，为控制耐药菌株播散流行及治疗提供新的策略。　　质谱技术为临床微生物实验室提供了快速而准确鉴定细菌、分枝杆菌、真菌等的方法，其中临床标本的直接鉴定成为未来研究的方向。将MALDI-TOF MS与全自动药敏检测仪相连，整合到实验室自动化流水线后，可以提高检测速度，缩短患者住院时间，提高疗效，降低医院和患者的经济负担。另外MALDI-TOF MS与其他分子生物学检测技术联合，可以对临床产酶菌株的检测方法、基因分型及测序、蛋白质组学方面开展更加深入的研究。MALDI-TOF MS有望成为临床实验室微生物鉴定分型等领域发展的重要方向。

近年来，随着质谱技术的快速发展，离子源技术及质量分析器技术的变革，质谱仪器设计的快速改进，使得质谱仪成为化学分析领域尤其是 生命科学领域非常有效的一种分析工具。　　得益于质谱技术的发展，过去几十年来，许多临床检测实验室已经陆续引进 质谱技术，因为与传统的检测方法相比，质谱技术具有高灵敏度、高特异性和高准确度的特点。质谱技术在临床检验中的应用，主要涉及临床生化检验、临床免疫学 检验、临床微生物检验以及临床分子生物诊断等方面。在临床生化检验领域，由于串联质谱技术的高特异性、高准确度、高灵敏度、高简便性、线性范围宽及高通量 的优点，逐渐取代了部分传统的检测方法，使得生化检验结果更加准确可靠，对临床诊断的参考意义进一步提升 检测方式不再是一次分析只针对一种代谢物、一种 疾病，而是一次分析可针对多种代谢物、多种疾病。正是由于质谱技术在生化检验中的优异表现，进一步促进了质谱技术在临床检验中的迅速发 展。　　在美国，临床质谱技术已经发展得相对成熟，服务于临床检测的项目已达400余项 涉及产前检查、新生儿筛 查、滥用药物监测、代谢物检查(氨基酸、脂肪酸)、类固醇激素检测(内分泌)、维生素族检测以及微生物鉴定等领域。同时，在蛋白组学研究方面，也正在研究 如何从科研转化到临床应用。　　临床质谱技术在美国的成熟发展，离不开上下游供应产业的成熟发展和行业协会的推 动。在美国，较大型的质谱公司如SCEIX、Thermo Fisher、Agilent等不仅能提供质量较高的检测仪器，而且都积极配合临床质谱的发展，不断更新升级自身的软硬件设备及应用支持服务，使得质谱技 术在临床的应用获得强大的后盾支撑。同时，为了汇聚检验领域专家，共同促进行业对临床质谱分析的关注和理解，促进质谱成为健康管理的便利工具，2008 年，由David Herold教授等人在美国圣地亚哥发起举办了第一届Mass Spectrometry： applications to the Clinical Lab(MSACL)，即质谱在临床实验室的应用会议。会议以其高度的专业聚焦性受到了业界人士的广泛欢迎。会议宗旨是为质谱的临床应用发展研讨提供专业 的交流平台，专注专业的行业聚焦型会议，促进了行业人才的培养，加快了行业信息的流通，提高了新技术、新应用的普及率，很好地推动了质谱技术在临床检验实 验室的发展。　　当然质谱技术的发展除了其本身发展和应用的良好推广与实践外，更离不开行业政策环境的支撑。在美 国对临床质谱技术采用了有效兼顾监管和鼓励创新的LDT (Laboratory Developed Test)模式。在此模式下，只要是有临床实验室改进修正案(CLIA)执照的实验室，其研发的产品和技术服务就可以合法进入临床，合理收费。实验室取得 CLIA标准相关认证后，检测结果即可用于指导临床诊疗。该管理方式自实施以来，得到了患者、医院、第三方临检中心、保险公司的广泛认可，目前美国有近 25万个CLIA实验室。美国临床病理学会(ASCP)对LDT定义为：实验室内部研发、验证和使用，以诊断为目的的体外诊断实验。LDT仅能在研发的实 验室内使用，可使用购买或自制的试剂，但这些试剂不能销售给其他实验室、医院或医生。LDT的开展不需要经过FDA的批准。正是这种有效兼顾监管和鼓励创 新的LDT模式，极大地促进了美国质谱技术在临床应用中的快速发展。　　在中国，临床质谱技术属于较年轻的检测方 法，临床应用还处于起步阶段，少量第三方医学检验机构和大城市的三甲医院开展了利用质谱为手段的检测项目，数量十分有限，应用广度和深度远不如美国。在中 国临床质谱应用方面，以金域检验为代表的机构中，临床质谱的主要应用涉及新生儿筛查、药物浓度监测、代谢物检查(氨基酸、脂肪酸、胆汁酸)、类固醇激素检 测(内分泌检测)、微量元素检测、维生素族检测以及微生物鉴定等领域 检测项目数量有限，开展数量较多的金域检验公司也仅70余 项。　　中国的质谱市场上，仪器设备几乎被国外公司垄断，市场上应用较多的为SCIEX、Agilent、 Waters、Thermo Fisher、Shidmazu、Bruker等公司的产品 国产质谱仪器主要在部分研究机构有应用，距离实际的生产应用普及还有很大的距离。这一现状， 导致了中国的临床质谱的投入成本较高、技术支持服务有限，一定程度上限制了技术的发展。　　在行业政策环境方面，中国除香港外，没有开放的CLIA监管机制，也无明确的LDT政策。我国许多专家学者呼 吁，中国应该借鉴美国的管理模式，允许LDT项目，实现临床实验室检验结果的质量保证。这样既能控制风险，又能加速新技术的临床应用。在行业协会方面，非 常认可LDT项目，并在积极推动中国LDT项目的发展。2014年3月7日，上海医学会举行了“部分基因和质谱检测的实验室自建项目(LDT)的研讨 会”。在会上，上海市卫计委医政处、规财处和发改委领导均对LDT 开展表示支持，鼓励医院在保证质量的前提下，开展LDT项目试运行。上海医学会表示愿意作为学术平台，为政府机关和临床专家搭建沟通平台，希望在有关政府 机构的支持和监督下，规范而又稳步推进LDT项目，促进个体化诊疗的发展。　　在中国香港，由于LDT项目的开 放，临床质谱技术得到了很好的发展。质谱技术的高准确度、高灵敏度、高特异性以及低成本等特点，促使了香港很多检验机构已经用质谱技术完全替代了放射免疫 技术，用于临床检测服务 越来越多的免疫学方法项目也在逐步被临床质谱检测项目所替代。CLIA监管模式下的LDT项目的开放，是质谱等年轻技术发展的推 动力，希望中国能尽快形成LDT的氛围，促进临床质谱等新技术的发展。　　当然，中国临床质谱技术的发展，也受限于技术本身的局限性。这些局限性表现在几个方面，第一，临床质谱技术相较于传统免疫学技术：仪器自动化程度低，仪器 数据不能直接转化为可读数据，对技术人员的操作能力和专业数据处理能力要求高 第二，质谱仪器厂商的应用支持欠缺，也加大了对技术人员的要求，需要技术人 员具备较强的仪器使用与维护能力 第三，质谱技术本身属于高精尖技术，技术复杂程度较高，即使是化学领域的专业人才，也需要经过长期的培训和实践，才能掌 握。所以技术的复杂性对医学检验行业的技术人员是很大的挑战。正是基于技术局限性对人员的依赖和高要求，所以技术的发展渴求高水平、大批量的专业技术人才 的涌现。目前，在中国没有专门的临床质谱人才培养方案，也无专业的临床质谱行业协会或培训交流会议，临床质谱行业人才匮乏。这种人才匮乏的现状，也在一定 程度上限制了临床质谱技术的应用和普及。针对此种现状，一方面中华医学会检验分会，对临床质谱技术的聚焦呼之欲出，另一方面需要各界社会力量集聚、积极筹 备相应的培训交流会议。　　综合以上的中 美临床质谱发展的现状，中国的临床质谱行业较美国还有很大的差距。行业的发展，离不开有关部门、行业组织的多方推动。我们希望，中华医学会检验分会、质谱 仪器厂商、医院检验科、第三方医学独立实验室以及有关监管部门，共同联动，一起推动中国临床质谱行业的发展。我们也期待，在不久的将来，临床质谱技术能更 好、更广泛的为医学检验服务，让检验结果更加准确、快速、有效，造福病患。