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[align=center][b]眼刺激试验替代方法研究现况[/b][/align][align=center]杨淼（南京质检NQI）[/align] 眼刺激是指当外源性化学物暴露于眼部时，眼球及粘膜发生的炎症反应。可接触到眼的消费品，包括化妆品、日用洗化产品，药品等均需要进行强制性眼刺激试验的安全性评价。我国《化妆品安全技术规范》（2015年版）、《化学品测试方法》、《危险化学品安全管理条例》中均明确规定了眼刺激试验方法。上述规范中采用的方法均基于兔眼刺激试验（Draizeeye irritation test， Draizetest）设计，它是一种经典的评价化学物眼刺激的动物试验方法，主要做法是将受试物作用于家兔结膜囊内，观察角膜、结膜、虹膜的变化，并进行评分，根据评分对受试物进行分级。该方法操作较简单，无需复杂的仪器，但是主观性较强，动物实验外推到人的科学性存在争议，违背了目前减少动物试验的“3R”原则等，国内外已开始大力发展离体替代方法，现就这些方法进行综述。[b]1 离体器官替代法[/b] 离体器官替代法主要有牛角膜浑浊和渗透性试验（Bivinecorneal opacity and permeablity，BCOP），离体鸡眼试验（Isolatedchicken eye test，ICE），离体兔眼试验（Isolatedrabbit test，IRE）等。离体器官替代法主要是通过将新鲜分离的动物眼球或者角膜作为测试材料，通过检测角膜水肿、通透性和荧光素渗透评价角膜损伤程度。Prinsen[sup][/sup]等检测了21种不同刺激程度的候选化学物，发现ICE是最适合的替代方法，它正确区分出了有刺激性的每一种化学物。Cooper[sup][/sup]等用不同刺激程度的洗发水作为测试物，对BCOP和IRE的符合性进行测试。结果发现标准BCOP方法在暴露时间为10min和60min时，不能区分出低刺激和高刺激的洗发水。IRE的敏感性较高，加上角膜观察和水肿两项指标，判断结果与Draize试验一致性较高。因此，IRE是合适的替代方法。目前研究认为IRE和ICE几乎可覆盖所有类型的受试物，特别是对于严重刺激性的物质有良好的区分力。而BCOP主要适用于中度到中度刺激性物质，对区分轻度到极轻度的刺激物敏感性较低，一般将其作为Draize试验的初筛试验。2009年，BCOP、ICE和IRE成为OECD认可的眼刺激试验方法。[b]2 类器官替代方法[/b] 类器官替代方法主要包括鸡胚绒毛膜尿囊膜试验（Hen`s egg test on the chorio-allantoic membrane，HET-CAM），绒毛膜尿囊膜血管试验（Chorioallantoicmembrane vascular assay，CAMVA），CAM台盼蓝染色法（Chorioallantoicmembrane-trypan blue staining，CAM-TBS）。此类方法主要是利用CAM血管与人粘膜结构相近，反应类似的特点，以CAM为替代材料用于眼刺激效应的评价。TavasziJ[sup][/sup]等用HET-CAM方法对6种农药进行眼刺激评价，结果发现与Draize试验结果有良好的一致性。类似地，Scheel[sup][/sup]等对既往研究回顾发现，对137个样品（75%非刺激性，25%严重刺激性）进行HET-CAM和Draize试验，与GHS和DSD分级进行比较。结果显示整体一致性为80%~90%，HET-CAM方法呈现高特异性（96%~98%），但是敏感性较低（48%~65%）。因此，认为HET-CAM的结果应作为眼刺激评估证据的一部分而不能直接判断。多项研究验证结果分析，CAMVA方法和Draize试验结果间存在很好的相关性，可正确区分刺激物和非刺激物，但适合范围较窄，在轻度到中度的刺激性物质上有良好的表现，对于严重刺激性物质并不适用。有研究报道对60种化妆品的眼刺激性进行检测，组合CAMVA和BCOP方法明显提高检测准确的，预测范围扩大到无刺激性到严重刺激性[sup][/sup]。因此，将离体器官替代法和类离体器官替代法相结合是一个有前景的研究方向。[b]3 基于细胞的替代方法[/b] 基于细胞的替代方法是基于眼刺激发生后，上皮组织连接损伤，屏障功能障碍，角膜和结膜的上皮及内皮细胞损伤，产生应激反应，释放炎症因子。因此，通过检测受试物对细胞的功能及毒性作用影响可预测其眼刺激作用。中性红摄取（NRU）试验是其中一种，其原理是检测受试物抑制活性细胞摄取中性红染料的能力。此外，红细胞溶血试验（Redblood cell haemolysis test，RBC）是根据血红蛋白的渗漏量和氧合血红蛋白变性程度来评价受试物的眼刺激效果。有研究利用RBC试验对29种农药进行眼刺激分级，并与Draize试验结果比对，结果从McNemarBowker检验，Kappa检验和SpearmanR三个指标上评价RBC试验的可靠性，发现RBC试验尚不能完全替代Draize试验，但是可作为筛检试验的补充，提高评价的可靠性[sup][/sup]。 荧光素漏出试验(sodiumfluoresceinleakagetest，FLT)是一种基于细胞毒性作用的替代试验。将培养的上皮细胞暴露于待测物，检测荧光素渗漏或跨上皮通透性以鉴定待测物的眼刺激性。当上皮细胞结构完整时，荧光素不可透过，在化学物暴露的损伤下，细胞出现可通过染料的小孔。欧洲化妆品协会(COLIPA)组织专家研究发现，FLT能有效区分无刺激性和严重刺激性受试物，与Draize试验结果高度一致，能较好预测角膜、虹膜的刺激反应，是理想的眼刺激检验方法之一[sup][/sup]。荧光素漏出试验也是OECD认可的眼刺激试验之一。 除此之外，还发展有角膜上皮细胞短期暴露试验，人性化试验（常规使用局部麻醉剂，全身止痛药），眼刺激和腐蚀连续测试，重建人眼角膜上皮模型（RHCE）测试等方法。其中，OECD认可的方法有角膜上皮细胞短期暴露试验和重建人眼角膜上皮模型测试，其他试验尚待验证。[b]结语[/b] 体外试验的优势在于符合动物试验减少，优化，替代的“3R”原则，客观，可定量，同时也避免了动物实验周期较长、耗时、动物与人的种属差异等缺点，从而结果更精确，因此体外替代试验是目前的发展趋势。同时，体外实验的劣势也较明显，比如体外难以全面反映体内的机理，检测的毒性指标只是机体反应的某一部分，因此不同程度的出现了假阴性和假阳性，尚无任何一种单一体外试验能完全替代Draize试验。为了降低假阴性率和假阳性率，尽可能代替Draize试验，在充分研究眼刺激病理过程的基础上，对每种替代方法的分子生物学作深入的研究，找到最适当的判定终点，并确定其与体内过程的一致性，评估方法的可操作性，考虑多种替代方法的联合判定效应，根据化学物分类选择不同的联合试验方案，最终形成完善的眼刺激性安全性评价体系。参考文献：1 Prinsen MK, Koeter HB. Justificationof the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as analternativeto the Draize eye irritation test with rabbits. Food Chem Toxicol, 1993, 31: 69276.2 [url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0887233300000606?via%3Dihub#!][color=windowtext]K.JCoopera. L[/color][/url][url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0887233300000606?via%3Dihub#!][color=windowtext]K Earlce[/color][/url], [url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0887233300000606?via%3Dihub#!][color=windowtext]JHarbell.[/color][/url][url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0887233300000606?via%3Dihub#!][color=windowtext]Hraabe.[/color][/url]Prediction of ocular irritancy of prototype shampoo formulations by theisolated rabbit eye (IRE) test and bovine corneal opacity and permeability(BCOP) assay.Toxicology inVitro, 2001 , 15 (2) :95-1033 Tavaszi J , Budai P. The use of HET- CAM test in detectingthe ocular irritation.Communicationsin Agricultural & Applied Biological Sciences, 2007, 72 (2) :137.4 [url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0273230011000298#!][color=windowtext]JuliaScheel.[/color][/url] Marcus Klsber, [url=http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0273230011000298#!][color=windowtext]JürgenKreutz[/color][/url] et al. Eye irritation potential: Usefulness of the HET- CAM under the Globally Harmonized System of Classification and Labeling ofChemicals (GHS).RegulatoryToxicology and Pharmacology, 2011,59(3):471-4925 秦瑶，程树军，黄健聪等. 整合 CAMVA 和BCOP 方法检测化妆品的眼刺激性，中国比较医学杂志，2014，24（6）：78-826 薛金玉，杨杏芬，杨颖等. 红细胞溶血实验替代兔眼刺激性实验检测农药眼刺激性初步研究，中国职业医学，2010，37（6）：469-471[align=left]7 S Perrot ，H Dutertrecatella ，C Martin et al. Resazurin metabolism assay is a new sensitive alternative testin isolated pig cornea.ToxicologicalSciences An Official Journal of the Society of Toxicology, 2003 , 72 (1):122-129[/align]

我们日常工作中，接触的试剂或多或少的都具有刺激性气味，有的刺激性强，有的刺激性弱，那么在检测的过程中，你通常是[color=#DC143C]如何预防试剂对鼻子的刺激[/color]？什么程度的试剂我们采用[color=#DC143C]口罩防护[/color]？什么程度的试剂我们采用[color=#00008B]防毒面具[/color]防护？