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[font='calibri'][size=13px]10种免疫荧光检测方法详解!从入门到专业![/size][/font]免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括,细胞固定和通透,封闭,孵育一抗,二抗等。除了这些基本步骤,接下来的实验方法希望可以帮到您。1. 细胞固定和通透为达到蕞佳的检测效果,细胞需要经过固定和通透。步骤很重要,细胞和抗原需要保证蕞佳的结构,并利于抗体与抗原结合。通常情况下,2. 抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体,可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下,纯化抗体的效果很好,但是正确的对照可以帮助精-准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照,有利于减少降低背景干扰。3. 合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色,通常情况下 1ug/ml 的纯化抗体或者 1:100-1:1000 的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下,可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第1次使用该抗体或测定某抗原,强烈建议浓度梯度实验。4. 优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色,但是对于某些目的抗原,更换一下含有不同离子的缓冲液,比如钙、镁、钾等,可以带来很大程度上的改善。Rockland 可提供优化过的 IHC 用封闭缓冲液,同样适用于荧光染色实验。5. 选择正确的二抗如果您需要做免疫实验,我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验;如果是双重甚至是多重染色,那么必须使用预吸附的二抗。同时,请优先选择来自同一物种的二抗。6. 使用合适的细胞密度选择合适的细胞数量进行染色,当细胞数量过多时,细胞结构不好,导致染色背景深,低细胞密度,会使细胞贴壁不佳,状态不好。7. 多重染色对同一样本进行两个不同抗原的检测时,可以用各自的抗体进行同时染色,但要求两个一抗的种属来源不同,标记物不同,而二抗的种属来源需保持一致。8. 降低背景高背景是免疫荧光常见的问题,解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 BSA 做封闭液,降低抗体浓度,增加洗涤次数,洗涤至少三次,每次五分钟,推荐洗涤液为 PBS+0.05%Tween。9. 封片作为免疫荧光的蕞后一步,可以提高折射率,保护样品。10. 数据分析观察整体样片时,选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。以上是10种检测方法,但是针对免疫荧光检测服务,推荐义翘神州,服务优势:①技术员长期从事抗体质量控制工作,经验丰富。②拥有包括Nikon A1激光共聚焦显微镜等重要仪器,可满足您对样片、活细胞等样本的静态和动态观察拍摄。③检测结果准确、重复性高,实验结果可直接用于论文发表。更多免疫荧光检测服务详情可以参看https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service
[font=宋体]在生物医学研究和治疗领域,[/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][u][font=宋体][color=#0000ff][b][font=宋体]单克隆抗体([/font][font=Calibri]mAbs[/font][font=宋体])[/font][/b][/color][/font][/u][/url][font=宋体][font=宋体]扮演着越来越重要的角色。特别是在癌症和慢性疾病的治疗中,抗体的亲和力[/font][font=宋体]——即其与目标抗原结合的紧密程度[/font][/font][font=宋体],[/font][font=宋体]直接影响[/font][font=宋体]抗体药物的[/font][font=宋体]治疗效果。因此,开发一种既准确又可靠的抗体亲和力测定方法,对于提高治疗效率和开发新型抗体药物至关重要。[/font][b][font=宋体]传统[/font][font=宋体]的亲和力测定[/font][font=宋体]技术[/font][/b][font=宋体]目前存在多种测[/font][font=宋体]定[/font][font=宋体]抗体亲和力的方法,如放射免疫[/font][font=宋体]分析[/font][font=宋体][font=宋体]、表面等离子共振([/font][font=Calibri]SPR[/font][font=宋体])、流式细胞术[/font][/font][font=宋体]、酶联免疫吸附分析和动力学排阻分析[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]。作为一种成功的候选治疗药物,[/font][font=宋体][font=Calibri]mAbs[/font][font=宋体]必须能识别目标抗原上的天然表位,因此需要一种更加快速灵敏、直观简便的测定方法。[/font][/font][b][font=宋体]基于细胞的荧光法:一种新的[/font][font=宋体]检测[/font][font=宋体]技术[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]Yu[/font][font=宋体]等人在杜克大学医学中心的研究中,开发了一种基于细胞的荧光[/font][/font][font=宋体]检测[/font][font=宋体]法[/font][font=宋体](如基于细胞的[/font][font=宋体][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法[/font][/font][font=宋体])[/font][font=宋体],用于测[/font][font=宋体]定[/font][font=宋体][font=宋体]抗体亲和力。这种方法通过使用荧光标记的抗体,并将其加入到固定在[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔板上的抗原阳性和抗原阴性的细胞系中,通过计算特异性结合和非特异性结合的差值来测量抗体的亲和力。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]研究者通过与传统的流式细胞术和放射性([/font][font=Calibri]I[/font][/font][sup][font=宋体][font=Calibri]125[/font][/font][/sup][font=宋体][font=宋体])[/font][font=Calibri]Scatchard[/font][font=宋体]分析方法进行比较,验证了基于细胞的荧光法的有效性。结果显示,新方法得到的解离常数[/font][font=Calibri]KD[/font][font=宋体]值与传统方法相当,证明了这一新技术的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体]此外,研究还展示了如何使用这种荧光法进行竞争性结合分析,进一步验证了抗体与抗原的特异性结合。这一功能对于研究抗体的结合表位和选择高亲和力抗体具有重要意义。[/font][b][font=宋体]基于细胞的荧光法的优势[/font][/b][font=宋体]与[/font][font=宋体]流式细胞术和[/font][font=宋体][font=Calibri]I[/font][/font][sup][font=宋体][font=Calibri]125[/font][/font][/sup][font=宋体]比色法等[/font][font=宋体]传统方法相比,基于细胞的荧光法具有多项优势。首先,该方法不使用放射性同位素,减少了实验的安全风险。其次,使用完整的细胞而非纯化的蛋白质,能够更真实地模拟抗体与天然抗原的相互作用。此外,该方法操作简便,成本低廉,适合高通量筛选,且能够在短时间内完成大量样本的分析。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尽管基于细胞的荧光法具有诸多优势,但也存在一些局限性。例如,对于复杂样品的处理可能会产生非特异性结合,导致结果的误判。然而,随着技术的不断优化和发展,这些问题有望得到解决。[/font][font=宋体]尽管目前还未有人利用[/font][font=宋体]基于细胞的荧光法[/font][font=宋体]来评估抗体亲和力,但是其自身具备的优势[/font][font=宋体][color=#182026]表明[/color][/font][font='Segoe UI'][color=#182026]该方法具有作为抗体亲和力检测方法的潜力[/color][/font][font=宋体],为抗体药物的开发和研究提供强有力的支持。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][/font][font=宋体]本篇[/font][font=宋体]文章[/font][font=宋体]由[/font][font=宋体]义翘神州[/font][font=宋体]编辑[/font][font=宋体]整理[/font][font=宋体],[/font][font=宋体]同时[/font][font=宋体]义翘[/font][font=宋体]神州[/font][font=宋体]提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/spr-bli-assay-services][u][font=宋体][color=#0000ff][b][font=Calibri]SPR/BLI[/font][font=宋体]亲和力测定服务[/font][/b][/color][/font][/u][/url][font=宋体],[/font][font=宋体]详情[/font][font=宋体]请[/font][font=宋体]点击[/font][font=宋体]![/font][font=宋体][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]参考文献:[/font][font=宋体][font=Calibri]Yu X, Pegram CN, Bigner DD, Chandramohan V. Development and validation of a cell-based fluorescent method for measuring antibody affinity. J Immunol Methods. 2017 442:49-53. doi:10.1016/j.jim.2016.12.004[/font][/font][font=Calibri] [/font]
日本KIKKOMAN公司的ATP荧光检测仪原理: 细菌以及食物残渣中含有大量的ATP,通过特定试剂的作用,使细菌及食物细胞的细胞膜透性增强,以便ATP从细胞中释放出来。ATP与荧光素/荧光素酶反应发光,发光程度与ATP的含量成正比关系,而ATP的含量又与细菌及食品残留的多少成正比关系。即:发光程度与细菌及食品残留含量成正比关系。 ATP + (Luciferin + Luciferase) = Light 检测仪器参数:检测限: 10-15mol ATP检测时间: 10秒钟数据输出: RLU(相关光度值)存储空间: 1200个数据显示: LCD电脑传输: RS232C/USB打印: 可选购电源: 1.5V, R6, AA电池两节尺寸: 80×203×50重量: 280克(无电池情况下) 优势:具有专利保护的ATP/AMP检测方法,同时可以检测ATP和AMP,已使检测结果更加精确和稳定。所用的酶可以抵抗清洁剂,防止用在生产上的清洁剂影响酶的活性试剂长效稳定,使用非常方便 世界上第一台可以检测ATP的同时还可以在把AMP转化成ATP,所以可以使结果更加准确和稳定。同时KIKKOMAN公司的ATP细菌检测仪可以检测表面的细菌量(估计值),有兴趣请来电:021-65110203/651101339-28 赵先生或者我们的网站:www.biochemmu.com