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液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区,其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内,应该只有一个细胞或粒子通过激光束。 因此,必须在样品室内把细胞注入鞘液流。样品室是液流系统的核心部件,在样品室内细胞液柱聚焦于鞘液中心,细胞在此与激光相交。样品室内充满鞘液,根据层流原理,在鞘液的约束下,细胞排成单列出样品室喷嘴口,并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计,使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态,这个过程称为流体聚焦。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/12/201412251405_528922_2648817_3.jpg图1 液流系统 单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出,粒子或细胞在流动室内与激光相交,此交点为测量区。 流动室是仪器核心部件,被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成,并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔,供细胞单个流过,检测区在该孔的中心,这种流动室的光学特性良好,流速较慢,因而细胞受照时间长,可收集的细胞信号光通量大,配上广角收集透镜,可获得很高的检测灵敏度和测量精度。 流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包,鞘液流是一种稳定的液体流动,鞘液以匀速运动流过流动室,在整个系统运行中流速是不变的,样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦,使样品流不会脱离液流的轴线方向,并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而得到准确的细胞荧光信息。
LASER是light amplification by stimulated emission ofradiation.的缩写。意为“受激发射的辐射光放大”。1964年按照我国著名科学家钱学森的建议将“光受激发射”改称“激光”。 本特利流式细胞仪中使用的氩离子激光器是一种固体激光器。这种激光器的特点是频率稳定性高,相干性好,寿命长。激光是这样产生的:当高压放电激发电子,电子吸收能量跃迁到高能级,然后在短时间内释放光子,回到基态。等离子管末端的光学系统来回反射光子。这些光子与其它受激电子相互作用,释放出更多与其波长、相位、方向相同的光子,随着光子数量的增加,光信号得到放大产生激光,并通过放电管尾部的布鲁斯特窗产生偏振,以最小损耗率传送。我们在等离子管周围加一磁场,对带电粒子起约束作用,以提高放电区中心的电子密度和离子密度,从而提高了输出功率。 目前台式机FCM,大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源,它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照,是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动,每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右,每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱,与被照射的时间和激发光的强度有关,因此细胞需要足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前,先经过透镜将其聚焦,形成几何尺寸约为22μm×66μm,即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布,为保证样品中细胞受到的光照强度一致,须将样本流与激光束正交,且相交于激光能量分布峰值处。 激光光束在到达流动室前,先经过透镜,将其聚焦,形成短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布,为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致,须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处。光路调节通过仪器光学部分三个旋钮调节,对用户是相对封闭的,即安装时由工程师调试完毕后,不推荐用户作任何调节。
液流问题是流式细胞仪发展史上占有很重要的地位。从本世纪30年代-50年代,流式细胞仪发展迟缓的一个重要原因就是细胞悬液通过毛细管或小孔时的阻塞问题得不到解决,直到引入层流鞘液的方法后,不但使液流更加稳定,约束细胞在液柱中间,而且较彻底的解决了阻塞问题。1、稳流与雷诺数 当液体流动时,有时是稳定的流动,称之为稳流,有时会产生漩涡,称之为湍流。上世纪,雷诺(OsborneReynolds,1842-1912)发现了一个以他名字命名的数-雷诺数,其定义如下:在一个直径为d的管子内,流动液体的平均速度为http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/12/201412251340_528895_2648817_3.jpg,如果液体的密度为ρ,粘滞系数为η,则雷诺数Rehttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/12/201412251158_528874_2648817_3.jpg 当Re=2300时,为稳流和湍流的分界点。当Re2300时为湍流。在流式细胞仪中我们希望保持稳流。如果喷孔直径为100μm,水的密度为1g/cm3,水在20℃时的粘滞系数是0.010泊(poise,1泊=1g/cm.s),代入上式,可以计算出 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/12/201412251341_528896_2648817_3.jpg 这是流式细胞仪喷孔速度的极限。考虑到湿润等因素的影响,常限制喷射速度在10m/s以下。2、喷嘴 本特利流式细胞仪采用进样针,实际上就是通用型流式细胞仪的喷嘴,见图1。喷嘴中间是含有细胞悬液的样品,样品外面包围着鞘液从喷嘴中喷出。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/12/201412251343_528897_2648817_3.jpg图1 IBC-M进样针 由于样品中可能含有牛毛、草屑、沙土、饲料颗粒等杂质,对进样针和样品室堵塞。所以当出现样品测定值持续偏低的时候,建议清洗完以后重新测定微球,观察微球的峰型是否尖锐、对称、呈正态分布,电压值是否在0.9-1.1之间。如果出现异常,建议用通丝通下进样针和样品室后重新测定。3、样品室 样品和鞘液相混合的小室成为流动室(cell),也称之为样品室、观察室等。样品室常以有机玻璃、光学玻璃或石英等制成,其做工精巧、尺寸准确、价格昂贵,是流动系统的心脏。其设计要求在流体力学上、光学上、机械学和电学上都十分稳定,见图2和图3。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/12/201412251348_528898_2648817_3.jpg图2 样品室组件http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/12/201412251348_528899_2648817_3.jpg图3 样品室 图2[/f