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化学发光分析及其临床应用居军 甘肃省人民医院(兰州730000) 内容提要:化学发光分析是根据化学反应产生的光辐射强度确定物质含量的一种痕量分析方法,可与电化学分析、免疫分析、固定化试剂技术、传感器技术等分析技术联用,具有灵敏度高、线性范围宽、不需要外来光源、分析速度快、仪器设备相对简单、便宜等优点。常用的化学发光技术有电化学发光、化学发光免疫分析、微粒子化学发光等。化学发光分析在临床实验室中主要应用于激素、肿瘤标志物、传染病监测、血药浓度检测等。关键词:化学发光 临床激素 肿瘤标志物 传染病 近年来,化学发光分析技术发展很快,特别是化学发光免疫分析技术,在临床医学应用中发挥着越来越重要的作用。1化学发光 化学发光分析是根据化学反应产生的光辐射的强度确定物质含量的一种痕量分析方法。一些物质在进行化学反应时,吸收化学反应过程中所产生的化学能,使分子处于激发态,当其回到基态时以光子的形式释放能量。反应必须提供足够的化学能,通常只有焓变在170—300KJ/mol之间的放能反应才能产生可见光范围内的化学发光现象。化学发光分析具有灵敏度高、线性范围宽、不需要外来光源、分析速度快、仪器设备相对简单、便宜等优点。化学发光分析灵敏度可达到10-18mol/L,而通常酶联免疫技术的分析灵敏度只能达到l0-13mol/L,新型的微珠包被酶放大免疫技术的分析灵敏度可达到10-14mol/L,荧光免疫及采用沉降法的普通放免技术分析灵敏度可达到10-ls mol/L,固相放免技术分析灵敏度可达到10-16 mol/L。化学发光反应体系有鲁米诺、光泽精、过氧草酸盐(或酯)一荧光物质-H202、Ru(bipy),2+/Ru(Phen),2+等电致发光、Ce(IV)、高锰酸钾一还原性有机物等。化学发光分析测定的物质可以分为3类:第1类物质是化学发光反应中的反应物;第2类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂;第3类物质是偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。化学发光分析测定物质的方式可分为直接法和间接法。化学发光分析反应类型可分为酶促反应和非酶促反应两类。此外化学发光分析法可以与其他分析技术联用,如流动注射分析、电化学分析、免疫分析、固定化试剂技术、传感器技术等分析技术相结合。2常用的化学发光技术 电化学发光是通过对电极施加一定的电压进行电化学反应而发光,通过测量化学发光光谱和强度来测定物质含量的一种痕量分析方法。它将电分析化学手段和化学发光方法相结合,具有独特的优点,如重现性和灵敏度进一步提高,在多种组份同时存在时,可施加不同波形、不同电压的信号进行选择性测量等,是潜在的分析手段之一。 化学发光免疫分析是以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法,具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、操作方便、分析速度快和容易实现自动化等优点。鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯衍生物、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶是目前化学发光免疫分析中使用最多的标记物。 微粒子化学发光是化学发光免疫分析的特殊形式,是以化学发光剂为底物的酶免疫技术,同时应用了磁性微珠做固相载体,增加了吸附面积,使抗原抗体最大限度的结合。以3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧酰).苯基.1,2一二氧环乙烷(AMPPD)为发光底物在碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的作用下,迅速去磷酸酶,生成不稳定的中介体AMPPD-,进而产生激发态产物,当其跃迁回到基态时产生光子。微粒子化学发光技术所需标本量极少,孵育时间大大缩减,同时因其选择性吸附抗原,从而提高了特异性、灵敏性,使测定结果准确、可靠,并减少污染。 化学发光生物传感器是通过非创伤或非损伤性的办法,连续、实时、动态地检测生物体内的某一种或几种物质浓度的技术。该技术以化学发光作为换能器,不但继承了化学发光高灵敏度的优点,而且大大提高了化学发光的选择性。按照所固定化的生物组分的种类,可以将化学发光生物传感器分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、核酸传感器及微生物传感器等。特别是化学发光免疫传感器是将具有分子识别作用的抗原或抗体以适当的方式固定化而制成,它结合了化学发光高灵敏度和抗原抗体特异性结合的高度专一性以及无污染等特点,是替代放射免疫分析的重要分析工具,已日益受到重视。 化学发光核酸探针已用于检查病毒、细菌和原虫的DNA。以鲁米诺增强化学发光检测体系的核酸探针主要有两种形式,一种是用生物素标记探针,杂交后经过分离,再以过氧化物酶标记的亲和素与生物素结合,加入鲁米诺和增强剂后测发光。另一种是以过氧化物酶直接标记探针,用增强的鲁米诺检测发光。核酸探针亦可用吖啶酯或AP来标记,吖啶类发光体系发出的是瞬时光,而AP以AMPPD作为发光底物,其发光体系具有发光持续稳定的特点,发光时间可长达几天,既可用发光仪也能用简单的感光胶片检测。另外,AP-AMPPD发光体系具有非常高的灵敏度,无论是固相还是液相检测,对标记物碱性磷酸酶的检测限可达10-21(1000 AP分子),是目前最灵敏的核酸测定方法之一,已用于检测B19微小病毒DNA、人乳头瘤病毒DNA(HPV).巨细胞病毒DNA(CMV),并在DNA测序中有很好的应用。3化学发光分析在临床实验室中的应用 激素是由内分泌腺或内分泌细胞分泌的高效生物活性物质,在体内作为信使传递信息,对机体生理过程起调节作用,通过调节各种组织细胞的代谢活动来影响人体的生理活动。通过调节蛋白质、糖和脂肪等三大营养物质和水、盐等代谢,为生命活动供给能量,维持代谢的动态平衡,促进细胞的增殖与分化,影响细胞的衰老,确保各组织、各器官的正常生长、发育以及细胞的更新与衰老。影响中枢神经系统和植物性神经系统的发育及其活动,是生命中的重要物质。激素在血液中的浓度很低,一般蛋白质激素的浓度为10-10~10-12mol/L,其他激素在l0-6~10-9mol/L。目前临床上用化学发光可测定大部分激素,如E2、E3、T3、T4、fl'4、TSH、HCG、p-HCG、甲状腺球蛋白(TG)、抗甲状腺球蛋白(ATG)、甲状腺结合球蛋白(TBG)、抗甲状腺过氧化物酶(ATPO)等。 肿瘤标志物是癌细胞生长过程中产生的一种或几种正常情况下没有的或含量很低的“特异性”物质,或是宿主细胞因癌细胞入侵而过量产生的正常细胞组分。肿瘤标志物存在于组织、细胞、血液或体液中,肿瘤标志物的检测对肿瘤高危人群的筛选、肿瘤的诊断和鉴别诊断、肿瘤分期、肿瘤定位、肿瘤治疗等都具有一定的意义。尤其在肿瘤治疗过程中,肿瘤标志物浓度的升高和降低与疾病的预后密切相关,肿瘤标志物测定对恶性肿瘤的预后具有监测价值。同时应当注意,现今所知的肿瘤标志物中,绝大多数不但存在于恶性肿瘤中,而且也存在于良性肿瘤、胚胎组织,甚至正常组织中。因此,这些肿瘤标志物并非恶性肿瘤的特异性产物,但在恶性肿瘤患者中明显增多。因此肿瘤标志物也称为肿瘤相关抗原。肿瘤标志物的检测仅仅是配合临床医生对肿瘤诊断、治疗、监测的辅助手段。检测出的结果要根据其它临床检测结果综合判断。肿瘤标志物的检测方法历经了血球凝集法,电泳法、放免法、荧光免疫法,酶联免疫吸附法,微粒子法等,特别是电化学发光法、化学发光法新技术逐渐地应用到全自动免疫分析系统中,使肿瘤标志物的检测更敏感、更准确。目前常用的肿瘤标志物有:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖原125(CA-125)、糖原153(CA-153)、糖原199(CA-199)、糖原724(CA-724)、糖原211(CA-211)、糖原242(CA-242)、铁蛋白(Fer)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、前列腺特异性抗原(PSA)、组织多肽抗原(TPA)等。 传染病的疗效监测,特别是病毒性肝炎的防治,已列为我国重大传染病专项课题。用化学发光分析技术对病毒标志物进行定量检测,与ELISA方法相比,大大提高了检测灵敏度,是临床治疗的重要依据。已成为临床应用的常规手段。 血药浓度检测是合理、安全用药,评估药效的重要手段,而化学发光分析的优点恰好满足药物分析对分析方法提出的要求,使得它在药物分析领域也有较为广泛的应用。利用该技术可对抗菌素、中枢神经系统药物、循环系统药物、维生素、代谢产物及生命相关物质进行分析,对临床药理和药物治疗的研究都起到重要的推动作用。
摘要:对近年来化学发光分析法的研究应用最新进展作了评述,包括化学发光试剂的类型,化学发光在无机、有机及药物分析中的应用,全文引用文献105篇。 关键词:化学发光分析;应用进展;综述 RECENT DEVELOPMENT OF CHEMILUMINESCENCE ANALYSIS ZHANG Li—li,ZANG Li—guo,CHEN Zhen-zhen,TANG Bo Abstract: The recent development of chemiluminescence analysis was reviewed.The analysis of inorganic,organic and medicine samples as well as the chemiluminescence reagent were related with 105 references. Keywords:Chemilum inescence analysis;Recent progress;Review 化学发光分析法是近3O年来发展起来的一种高灵敏的微量及痕量分析法,具有仪器设备简单、操作方便,灵敏度高,线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点。近年来,在改进和完善原有发光试剂和体系的同时,新发光试剂的合成,新体系的开发,与其它技术的联用,尤其是流动注射技术,传感器技术,HPLC技术及各种固定化试剂技术的联用,更显示出化学发光分析快速,灵敏,简便等优点,也进一步拓宽了化学发光的应用范围,现在已广泛应用于矿物岩石分析、材料分析、环境保护监测、药物分析和临床分析等方面。 1 化学发光试剂的类型 1.1 鲁米诺类 鲁米诺作为一种有效的化学发光试剂目前仍受到广泛应用。利用金属离子或过渡金属离子的不饱和配合物对鲁米诺发光体系有很强的催化作用,可以测定金属离子或有机配体。张虹蔚等以苯甲酸与Cu(II)形成的不饱和配合物对鲁米诺-H2O2体系的催化作用为基础,建立了测定苯甲酸的流动注射分析方法。李绍卿等_2 利用钛铁试剂与Co(II)形成的配合物对鲁米诺一H2O2体系增强作用,建立了钴的化学发光分析新方法。 利用有机化合物或稀土离子对鲁米诺化学发光反应的抑制作用,测定对化学发光反应具有猝灭作用的有机化合物或稀土。陈华等 利用碱性条件下扑热息痛对鲁米诺-铁氰化钾体系发光反应的强烈抑制作用,建立了流动注射化学发光测定痕量扑热息痛的新方法。通过偶合反应可以间接测定无机或有机化合物。李峰等将生成H2O2的葡萄糖_葡萄糖氧化酶(GOD)的酶促反应与鲁米诺-KIO4-H2O2的化学发光反应相偶合,建立了一种流动注射化学发光测定葡萄糖的新方法,用于人血清中葡萄糖含量的测定。利用有机化合物对鲁米诺发光体系的增敏作用,可以测定此类有机化合物。杨季冬基于吩噻嗪类药物盐酸异丙嗪和盐酸氯丙嗪对K3Fe(CN)5-鲁米诺体系的发光有强烈的增强作用,测定了两个吩噻嗪类药物片剂。 1.2 光泽精类 光泽精(N,N-二甲基-9,9-联吖啶二硝酸盐)以硝酸盐形式存在,在碱性介质中,可与还原性物质作用发光。基于此,朱智甲等采用Jones柱在线还原产生Fe(Ⅱ)、Mo(Ⅲ)、V(Ⅱ)、W(Ⅲ),研究了这些离子与光泽精的化学发光反应,并建立了相应的流动注射化学发光分析法,分析效率高。此外,光泽精还可用于测定胍基化合物[1 。庄惠生等研究出另外三种光泽精衍生物,发现其中DMDSBA的化学发光强度是光泽精的22倍,为设计合成新的发光试剂提供了一定理论和实验依据。 1.3 钌(Ⅱ)-联吡啶配合物钌(Ⅱ)-联吡啶配合物具有独特的化学稳定性、氧化还原性和发光性,在硫酸介质中,它能与氧化剂产生化学发光,加入某些有机物可以增强其发光强度,且发光强度与有机化合物浓度呈线性关系。基于此,可以测定这些有机化合物。近来,可用钌(Ⅱ)-联吡啶配合物为发光试剂测定的物质比较多,如测定硫脲、6-巯基嘌呤、四环素、戊二醛、DNA、可待因、肉桂酸、葡庚糖酸、丙酮酸、核酸等。 1.4 新合成的化学发光试剂 李善茂等利用α-酮酸和4,5-二胺基邻苯二酰肼合成了三种发光试剂:EDIQ、HDIQ、CEDIQ,并详细地研究过氧化氢浓度、铁氰化钾浓度和氢氧化钠浓度对化学发光强度的影响,并对其化学发光性能进行了研究,发现新发光试剂EDIQ、HDIQ、CEDIQ发光强度分别为鲁米诺的0.83、3.51、1.92倍。LI等合成了新发光试剂DTMC,可用于测定H202,灵敏度高,检出限为4.0×0.00000001mol/L。Sakata等利用氨基吡嗪类似物作为化学发光试剂测定丙酮酸,经过试验,发现在四种氨基吡嗪类似物中,2-氨基-5-3,4,5-三甲基苯基)吡嗪是最灵敏的一种,化学发光强度大约是与氨基吡嗪在一起所获得的化学发光的四倍。 1.5 其它类型的化学发光试剂 在酸性条件下,KMnO4有很强的氧化性,可与许多物质发生化学发光反应,依此来测定吡哌酸、DL-酪氨酸、甲氧氯普胺等。 Ce(Ⅳ)可与水杨酸或头孢氨苄形成化学发光体系,从而实现了它们的测定。利用氟喹诺酮类对亚硫酸盐和Ce(Ⅳ)反应的增敏作用,可以测定此类物质。 此外,还有另外几种,如吐温80。钌(Ⅱ)邻菲咯啉、焦性没食子酸、槲皮素(QCT)等,这些发光试剂应用不多,有待于开发研究。
技术参数 1.MPI-B型多参数化学发光分析测试系统—多功能化学发光检测仪: * 测量动态范围:大于5个数量级 * 测量精度优于0.05% 2.MPI-A/B型多功能化学发光检测器: * 波长范围:300—650nm * 灵敏度: SP1000A/Lm 上述两项构成了基本化学发光分析系统 3.MPI-B型多参数化学发光分析测试系统—电化学分析仪: * 电位范围:-10V—10V * 电流范围:±250 mA * 参比电极输入阻抗:10E12Ω * 灵敏度:1x10E-12—0.1A 共16个量程 * 输入偏置电流:50pA * 电位增量:1mV * 扫描速率:0.0001—200V/S * 测试方法:循环伏安法(CV),线性扫描伏安法(LSV),计时电流法(CA),计时电量法(CC),控制电位电解库伦法(BE),开路电压—时间曲线(OCPT) 4.MPI-BH/BU型多参数化学发光分析测试系统—毛细管电泳高压电源: * 输出电压:0—20KV * 输出电流:0—300uA 5.MPI-BF/BE型多参数化学发光分析测试系统—微流控芯片多路高压电源: * 输出路数:4路(BF型),8路(BE型) * 输出电压:0—2000V/路 * 输出电流:0—2mA/路 * 高压接出方式:输出、断开、接地 * 输出电流保护控制:0—2mA * 设置程序步:10步 6.MPI-B型多参数化学发光分析测试系统—数控流动注射进样器: * 高精度蠕动泵宽范围数字调速系统:调速范围 0—99 转/分。 * 可实现多达12路管道进样(6道/泵)。 * 两独立16通道自动/手动阀,换向时间≤0.3S 技术文章 此仪器没有任何技术文章 主要特点 1.用于化学发光机理与方法研究。 2.用于化学发光应用研究。 仪器介绍 MPI-B型多参数化学发光测试系统是西安瑞迈分析仪器有限公司最新研制开发的,基于WINDOWS 系统操作平台的高性能分析测试装置。依托于系统所拥有的多通道化学分析数据采集与分析测试部件及多功能化学发光检测器(基本系统)和众多的专用分析控制部件,本仪器可应用于各种化学发光分析,如静态注射化学发光、流动注射化学发光、电化学发光、毛细管电泳化学发光、微流控芯片化学发光及多方法连用化学发光分析等。本系统采用的组合式结构,允许用户采用不同的部件组合构成各种化学发光测试系统。