单细胞基因分析

p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 什么叫做单细胞基因测序(Single-Cell Sequencing)? /span /p p 　　一句话说，就是单个细胞水平上对基因组进行测序。2013年，自然杂志把年度技术授予了单细胞 a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target=" _self" span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 基因测序 /span /a (Single Cell Sequencing)，认为该技术将改变 a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target=" _self" span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 生物界和医学界 /span /a 的许多领域。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 我们为什么要进行单细胞基因测序? /span /p p 　　传统的测序方法，无论是基因芯片或者二代基因测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)都需要从超过10万个细胞中提取一大堆(bulk)DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆细胞的平均值。但是传统的方法，对于理解人体细胞的多样性有着明显的局限性。 /p p 　　在人体的每一个组织中，比如说，肾脏组织，拥有着大量不同的细胞类型，每一种细胞类型有着独特的起源和功能。每一个细胞的谱系和发展的状态又决定了每个细胞如何和周围的细胞和环境如何反应，把基因测序应用到单个细胞层面，对于我们理解细胞的起源，功能，变异等有着至关重要的作用。 /p p 　　关于二代基因测序已经详细在我们的前期两篇深度报告中进行了介绍，在本篇报告中，我们将详细解读单细胞基因测序，以及该技术对癌症，辅助生殖以及免疫学等领域带来的新的突破。 /p p 　　 strong 一、单细胞基因测序行业：刚启程，面临引爆点 /strong /p p 　　BCC Research的一项分析报告指出，2014年全球单细胞分析(Single-cell Analysis)的市场达5.4亿美金，预测将从2015年的6.3亿美金增长到2020年的16亿美金，复合增长率达21%。根据GENReports的报告，关于单细胞分析的文章发表在过去的几年也有着爆发性的增长。 /p p style=" text-align: center " 　　图2：单细胞分析的文章发表数量 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/006c9fd7-a2cd-46b2-a028-18b51b5ea3cd.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：GEN，民生证券研究院 /p p 　　其中，传统的单细胞基因组学主要是由基因芯片和PCR主导的，随着二代基因测序的成本以超摩尔定律下降，目前单细胞基因组学逐渐由二代基因测序技术接棒。 /p p 　　和qPCR在90年代的发展一样，目前所有的刺激因素(高度的科研兴趣，生物医药巨头公司的关注等)正在解锁这个市场，单细胞基因测序行业正面临引爆点。 /p p 　 strong 　二、单细胞基因测序的基本流程：单细胞分离--基因组扩增--测序和分析 /strong /p p 　　单细胞测序，简单地说，主要经过如下的步骤：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增(全基因组扩增和全转录组扩增)---测序以及后续的分析和应用。 /p p style=" text-align: center " 　　图3：单细胞测序的步骤 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/782ee757-3c06-4a1b-9103-4c7336ac2929.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Recent advances and current issues in single-cell /p p style=" text-align: center " sequencing of tumors，民生证券研究院 /p p 　　2.1 单细胞的捕捉和分离 /p p 　　单细胞测序的第一步是单细胞的分离和提取，目前的方法主要有如下几种方法：流式细胞术，激光捕获显微切割技术以及微流控技术。 /p p style=" text-align: center " 　　图4：单细胞分离的三种方式：流式细胞术，激光捕获显微切割以及微流控技术 /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/ea66e087-c9b2-4930-a4d3-50025543fe8b.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Technologies for Single-Cell Isolation，民生证券研究院 /p p 　　1)流式细胞术 (Flow Cytometry) /p p 　　是指通过对于悬浮于流体中的细胞或者其他颗粒进行定量分析和分选的技术。在各种流式细胞仪中，大家主要讨论的是荧光活化细胞分类计FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)系统分离单细胞。定量原理：待测细胞经特异性荧光染料染色后，加入样品管中，经过测量区，由染色后的细胞在激光照射下的荧光产生的电信号来进行定量分析 分选原理：通过流束形成含有细胞的带电液滴来实现的。 /p p 　　2)激光捕获显微切割技术Laser Capture Microdissection(LCM) /p p 　　LCM技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。其基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑模-乙烯乙酸乙烯酯(EVA)膜，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。 /p p 　　3)微流控技术(Microfluidics) /p p 　　微流控技术是一种用于精确控制微量液体的技术。微流控芯片是实施该技术的平台，通常通过细微的管道对液体实施操控，微流控对液体的操控尺度, 刚好适合于单细胞样品的处理操作。 /p p 　　2.2 全基因组扩增 (Whole Genome Amplification. WGA)/ 全转录组扩增 (Whole Transcriptome Amplification，WTA)：单细胞测序的难点 /p p 　　2.2.1 主要的三种全基因组扩增技术，各有优势 /p p 　　由于在单细胞中的DNA和RNA的数量非常小(几个pg)，用传统的测序仪无法检测，所以科学家们必须首先对这些分子进行扩增，同时尽量的减少错误。目前的全基因组扩增技术主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，多重置换扩增(MDA) 和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。 /p p 　　1)基于PCR技术的全基因组扩增技术，例如DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增) /p p 　　DOP-PCR是一种部分随机引物法, 其引物构成为3& amp #8242 -ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5& amp #8242 ；主要 利用3& amp #8242 端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导, 以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，从而达到扩增整个基因组的目的。 /p p 　　2)多重置换扩增(MDA) /p p 　　MDA是一种等温的链置换扩增反应, 其使用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合, 接着利用 phi29DNA 聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。 /p p style=" text-align: center " 　　图5：DOP-PCR和MDA全基因组扩增技术简介 /p p style=" text-align: center " img title=" 4.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/d9b0aef0-e3b1-4c63-8313-c20796064bb3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Single-cell genome sequencing: current state /p p style=" text-align: center " of the science，民生证券研究院 /p p 　　3)MALBAC(Multiple annealing and looping-based amplification cycles)基于多次退火和成环的扩增循环 /p p 　　通过采用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而达到近乎线性的扩增,该技术是哈佛大学谢晓亮教授团队发明的。 /p p style=" text-align: center " 　　图6：MALBAC全基因组扩增的示意图 /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/83e2f828-d990-4b9c-afd6-bd692fc52888.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Single-cell sequencing by Doug Brutlag，民生证券研究院 /p p 　　表1：三种类型的全基因组扩增方式比较 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 302" title=" QQ截图20160302115018.jpg" style=" width: 600px height: 302px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/297e4e6e-a134-4101-a297-456cd703c3af.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Single-Cell Sequencing Technologies: Current and Future， /p p style=" text-align: center " 民生证券研究院 /p p 　　Navin 在研究报告中指出(来源：Cancer genomics: one cell at a time)，对于检测CNV(Copy Number Variation)的时候，DOP-PCR以及MALBAC较有优势，另一方面， MDA方法一般用来检测点突变。Gawad et al., (2015)更是指出，三种全基因组扩增技术并没有明显的胜者，具体方法的使用取决于研究的目的。 /p p 　　2.2.2 全转录组扩增 /p p 　　一个哺乳动物的单细胞大约含有10pg的RNA，其中mRNA大约在0.1-0.5pg，并不能满足目前测序平台的要求，所以需要进行全转录组扩增技术。 /p p 　　单细胞中提取的RNA首先经过逆转录出cDNA，然后对逆转录生成的cDNA进行扩增。目前主要的转录组扩增技术主要包括如下几种：传统的PCR，改进的PCR，T7-in vitro 体外转录组扩增以及Phi29聚合酶扩增。 /p p 　　三. 单细胞测序的主要应用：癌症，辅助生殖以及免疫学领域 /p p 　　当单细胞被分离，细胞内的DNA/RNA被提取和扩增后，二代基因测序(Next Generation Sequencing)可以用来进行后续的测序。当把基因测序应用于单个细胞层面，在下游应用领域有着先天独到的优势。 /p p 　　3.1单细胞基因测序技术有助研究癌症起因和治疗 /p p 　　首先谈一下癌症的异质性：中晚期的肿瘤或由一系列的肿瘤克隆组成，每一种克隆有着独立的变异，形态和药物反应。对于肿瘤克隆精准的诊断非常重要，因为一个占据原发性肿瘤5.1%的亚克隆种群在复发的时候可能成为主要的致病因素。 /p p style=" text-align: center " 　　图7：肿瘤的异质性 /p p style=" text-align: center " img title=" 6.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/88b49609-3a47-4577-ad2a-7e9b36b6a4dc.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Illumina，民生证券研究院 /p p 　　实体瘤由一系列不同的细胞组成，包括癌症纤维细胞，内皮细胞，淋巴细胞，巨噬细胞等。同时，实体瘤由多个肿瘤克隆亚种群构成，使得临床样本的分析更加复杂。当多个肿瘤克隆同时存在时，标准方法检测的要么是平均信号要么是主要的克隆群体(并不一定是最致病的)的信号。 /p p 　　而同时，肿瘤的异质性和癌症产生抗药性以及转移密切相关，所以，单细胞测序开始用来检测肿瘤内基因异质性，对于癌症起因以及后续治疗的研究非常关键和重要。 /p p 　　例如，Navin et al.(2011), 利用单细胞基因测序的方法(流式细胞术提取细胞-全基因组扩增-NGS)，在某个乳腺癌肿瘤组织中检测了100个乳腺癌细胞的CNVs，覆盖度大约6%，发现了三种完全不一样的克隆亚种群。 /p p 　　除了肿瘤细胞，单细胞基因测序同样可以应用于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells)和外周血播散肿瘤细胞DTC(disseminated tumor cells)，该部分内容将在后续的研究报告中深入讨论。 /p p 　　3.2 单细胞基因测序助力辅助生殖 /p p 　　PGS(Pre-implantation Genetic Screening)是胚胎注入前遗传学筛查，主要是通过检测胚胎的23对染色体结构、数目，来分析胚胎是否有遗传物质异常 PGD(Pre-implantation Genetic Diagnosis)，主要用于检测胚胎是否携带遗传缺陷的基因，关于PGS/PGD的介绍，请参考我们之前的行业深度《基因+大数据的颠覆：从癌症基因测序到辅助生殖》。 /p p 　　PGD过程中，目前主要有三种方式获得活检材料：1)卵子的第一极体和第二极体 2)培养至第3天胚胎卵裂期的卵裂球细胞(一般取1-2个细胞) 3)培养第5天左右的囊胚细胞。 /p p 　　例如，牛津大学的Dr.Dagan Wells团队，通过对囊胚细胞进行单细胞基因测序，选择健康的胚胎植入。另外，谢晓亮教授团队通过对女方卵细胞极体细胞进行测序，结合胚胎选择，选择正常的胚胎移植。 /p p style=" text-align: center " 　　图8：卵母细胞减数分裂产生极体的过程 /p p style=" text-align: center " img title=" 7.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/a1c2724b-0f2c-4b27-9eca-d304dccd613c.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Genome Analyses of Single Human Oocytes，民生证券研究院 /p p style=" text-align: center " 　　(注：其中PB1和PB2是第一极体和第二极体) /p p 　　3.3 单细胞基因测序打开免疫报多样性研究之门 /p p 　　用单细胞基因测序分析免疫细胞的原因是现存的多样的病原体导致了免疫细胞的高度异质性，传统的检测方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性，所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，从而理解机体复杂的免疫机制。正如开篇提到的Juno收购的单细胞基因测序公司AbVitro致力于T细胞和B细胞的基因测序。 /p p 　　图9展示了对单个T细胞受体基因测序(TCR Sequencing)的流程。TCR & amp #945 和& amp #946 mRNA经过逆转录，扩增，重叠延伸，目的基因被选择性地进行PCR扩增以及后续的分析。 /p p style=" text-align: center " 　　图9：TCR Sequencing过程 /p p style=" text-align: center " img title=" 8.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/04e7c357-80bd-4709-89dc-92ee07a28fa9.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR， /p p style=" text-align: center " Illumina，民生证券研究院 /p p 　　四. 单细胞基因测序未来的发展之路 /p p 　　在目前来看，单细胞基因测序还处在非常初级的阶段，也面临很多技术的挑战，包括：如何高效的分离细胞，全基因组无偏差的扩增，以及下游的数据分析等。但各大生物医药巨头都已经目光锁定了这个方向，除了今年初Juno收购AbVitro(单个T细胞和B细胞进行基因测序)，去年八月BD公司收购了单细胞测序公司Cellular Research。Illumina也通过和Clontech合作，推出了单细胞RNA测序服务。 /p p 　　我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进，如今，单细胞测序正面临着一场革命，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解基因组学，表观基因组学和转录组学的多样性。 /p p 　　背景案例： /p p 　　2016年1月，肿瘤免疫疗法的领头羊公司Juno宣布以1.25亿美金的股票和现金收购波士顿的一家单细胞测序公司：AbVitro Inc.。 AbVitro公司的技术起源于哈佛大学George Church的实验室，AbVitro的技术包括对单个T细胞和B细胞进行基因测序，帮助科学家们理解T细胞受体(T cell receptor & amp #945 和& amp #946 链的基因的复杂性。 /p p 　　图：Juno收购AbVitro之后的布局 /p p style=" text-align: center " img title=" 9.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/6ef1eca1-dc46-4600-9c6d-d95f77a85f9e.jpg" / /p

据美国物理学家组织网近日报道，最近，加拿大英属哥伦比亚大学与英属哥伦比亚癌症研究所、转化与应用基因组学中心合作，开发出一种硅酮材料的芯片实验室技术，能让每个细胞像弹球机里的球一样各就各位，然后进行基因检测。这种“单细胞基因分析”技术使基因检测更加灵敏迅速，有助于肿瘤分析和临床疾病的诊断。本周出版的《美国国家科学院院刊》对该芯片实验室进行了详细介绍。 　　这种芯片实验室大小跟一个9伏电池相当，能同时分析300个细胞。研究人员设计了一种路线，用液体载运细胞通过显微管道和一个个小阀门，当细胞挨个进入各自的小空位时，它们的RNA就会被提取出来，经过复制用于进一步分析。 　　标准基因检测要求使用大量细胞，才能得出由上千万不同细胞平均化以后的“综合图像”，这会掩盖细胞的真实属性和它们之间的相互作用。“这就好比用混合水果慕丝来研究草莓和树莓为什么不一样。”领导该研究的高通量生物中心副教授卡尔汉森介绍说，而单细胞分析正在成为基因研究中的黄金手段，因为即使是从同一肿瘤组织中采集的样本，也包含了正常细胞和多种癌细胞类型，而单细胞分析显出极微小的差异。 　　此外，这种芯片实验室几乎将所有细胞分析过程整合在了一起，不仅能分离细胞，还能用化学试剂将细胞混合起来，通过检测反应过程中的荧光发射获得它们的基因编码。所有这些都能在芯片上完成，不仅操作简单，而且成本效益高。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em font-size: 16px " /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em text-align: justify " 10月28日，中科院城市环境研究所崔丽研究员团队在期刊《Analytical Chemistry》上发表耐药基因水平基因转移最新研究。文章标题为“ /span i style=" text-indent: 2em text-align: justify " Phenotypic Tracking of Antibiotic Resistance Spread via Transformation from Environment to Clinic by Reverse D2O Single-Cell Raman Probing”。 /i br/ /p p img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/6221444b-ddc8-474b-b2fc-01abdfc691fd.jpg" title=" 企业微信截图_20201216144900.png" alt=" 企业微信截图_20201216144900.png" style=" text-align: center max-width: 100% max-height: 100% " / br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-size: 16px " 原文链接： /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a href=" https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c03218?ref=pdf" target=" _blank" span style=" text-indent: 2em font-size: 16px text-decoration: underline " https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c03218?ref=pdf /span /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 0, 0) " strong 【研究背景 span style=" text-indent: 2em " 】 /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 微生物耐药是一个危害公共卫生安全的全球性问题。耐药基因（antibiotic resistance gene，ARG）在环境或临床中出现并传播扩散。在这一过程中，水平基因转移（Horizontal gene transfer，HGT）现象起着不可忽视的作用。HGT的一个主要途径是转化（transformation）——受体细菌摄取胞外DNA（extracelluar DNA，eDNA）。这些eDNA多是细菌主动分泌或者裂解过程中释放的质粒DNA以及片段化DNA，常常携带着ARG。环境充当着ARG储库的角色，威胁着临床治疗。因此了解ARG从环境到临床转移的过程是必要的。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 在上述问题的研究中，常规方法依赖耐药菌的选择性培养或是报告基因标记eDNA技术。前者需要已知被筛选微生物的培养条件，且无法筛选出耐药但扩增不活跃的微生物。后者需要对eDNA等进行改造，不能反应实际的HGT情况。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 近年新兴了一种联合正向D2O标记的单细胞拉曼光谱方法用于微生物抗性区分。微生物利用环境中的D2O合成相关的生物分子，可以通过拉曼光谱的C-D带（2040-2300 cm sup -1 /sup ）进行表征。抗性环境中敏感菌与耐药菌会表现出不同D2O摄入，进而表现出不同的C-D峰情况。然而微生物不仅摄入D2O，还会摄入其他含H元素的营养物质，这导致单位时间C-D谱带的增长较低。同时较短时间的孵育也降低了该方法的灵敏度。 span style=" font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(0, 112, 192) " strong 作者团队改进并提出了反向D2O-单细胞-拉曼检测技术（reverse D2O single-cell Raman (Raman-rD2O) probing，Raman-rD2O）。微生物预先在D2O中孵育，后置换为含抗生素的H2O环境孵育并被检测。作者确定了该方法的有效性并利用该方法研究了HGT过程.。 /strong /span /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-size: 16px font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/noimg/94849f8b-b936-4174-925c-1ed3894541ed.gif" title=" ac0c03218_0007.gif" alt=" ac0c03218_0007.gif" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 0, 0) " strong 【实验设计 span style=" text-indent: 2em " 】 /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 这项研究中，为了评价微生物耐药性，作者建立了Raman-rD2O方法，确定了其有效性，以及灵敏度。之后在大肠杆菌体系中确认了水平基因转移的情况。接着评价了与来自于复杂环境中质粒共孵育的大肠杆菌对各抗生素（meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin）的耐药情况，并确认了该方法比传统培养方法更加准确。最后提出了一种用于反映ARGs传播风险的计算方法。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 0, 0) " strong 【结果讨论 span style=" text-indent: 2em " 】 /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong Raman-rD2O方法区分耐药菌以及敏感菌的灵敏度 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 对colistin耐药的FIT10（B. cereus）以及colistin敏感的DH5α（E. coli）菌株进行D2O培养12h。转移至含抗生素colistin的无D2O环境进行培养，取不同时间点进行拉曼图谱采集，结果如图 1。在C-D峰处可以看出，耐药菌FIT10峰强逐渐变低，非耐药菌DH5α无明显变化。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/324d314b-6c4d-41d3-97cd-3f0d1f1ad776.jpg" title=" 002.jpg" alt=" 002.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 图1 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图 1. 预先标记同位素D微生物在含0.125 mg/L colistin的LB培养基中培养0、0.5、1、4、8小时后的单细胞拉曼光谱（a）耐药菌FIT10，（b）敏感菌DH5α。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 采集含colistin培养条件下FIT10以及DH5α的单细胞拉曼图谱并统计C-D比值（CD/(CD + CH)），结果如图 2a-Ⅰ。另外比较了含ampicillin条件下的DH5α-Ampr以及DH5α数据，如图 2a-Ⅲ。可以看出该方法能够区分耐药菌以及敏感菌，且适用不同抗生素。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 从图 2a-Ⅱ/Ⅲ以及2b数据，可以看出正向标记方法4h后才能观察到差异。因此反向标记方法是优于正向标记的。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 394px height: 526px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/3db3bf0c-fe48-4a7e-8d06-4679a9ed238e.jpg" title=" 003.jpg" alt=" 003.jpg" width=" 394" height=" 526" / /p p style=" text-align: center " strong 图2 /strong & nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图 2. (a-Ⅰ，a-Ⅲ) 反向D2O方法下，不同时间点的colistin耐药FIT10、ampicilin耐药DH5α-Ampr以及DH5α的C-D比值统计结果；(a-Ⅲ，a-Ⅳ) 正向D2O方法下结果；(b) 1× MIC抗生素浓度下培养1h，反向D2O、正向D2O的单细胞拉曼图谱C-D区域结果。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong span style=" text-indent: 2em " 利用Raman-rD2O方法揭示转化过程中ARGs的水平基因转移 /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 作者比较了实验组JM109（E . coli）以及对照组DH5α、DH5α-Ampr 菌C-D比值。JM109预先与携带bla基因（编码抗ampicilin蛋白）的pMD19-T质粒共孵育。从图 3可以看出，DH5α组维持高的C-D比值，DH5α-Ampr 组比值降至6.4%以下。而JM109组分为了高比值群体以及低比值群体。这意味着JM109组中部分微生物获得了bla基因并表达，从而能在含ampicilin环境中进行代谢生长。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong HOOKE单细胞分选仪助力耐药基因水平基因转移研究 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 为了验证这一假设，作者利用 strong 长光辰英科仪（HOOKE instruments）的单细胞分选仪（PRECI SCS） /strong ，对各样品进行了单个细胞分选。对分选的单个微生物进行全基因组扩增后，通过PCR验证bla基因的携带情况。从图 3b可看出，DH5α组无bla基因，DH5α-Ampr 组携带bla基因，部分JM109组携带bla基因。这一结果印证了bla基因转移的假设。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/32f0c549-ecc1-41a1-a8b5-dc7775175666.jpg" title=" 006.jpg" alt=" 006.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 长光辰英科仪（HOOKE instruments）单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS /strong /p p style=" text-align: center " a href=" https://www.instrument.com.cn/zc/1835.html" target=" _blank" span style=" text-decoration: underline " （点击进入单细胞分析专场查看更多仪器信息） /span /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 作者统计了不同采集个数下耐药菌个数并计算了转化频率（Transformation Frequency = 转化菌个数/（10× 拉曼采集总数），10为微生物1h时扩增倍数）。采集数目大于40时，转化频率趋近4.33 × 10 sup -2 /sup 。该结果与传统平板培养方法得到的5.07 × 10 sup -2 /sup 一致。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 398px height: 795px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/5d4cd009-861e-4257-864f-d39b0a4467bb.jpg" title=" 004.jpg" alt=" 004.jpg" width=" 398" height=" 795" / /p p style=" text-align: center " strong 图3 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图 3. （a）预标记同位素D的E. coli DH5α（敏感对照），E. coli DH5α-Ampr（抵抗对照）以及转化了含bla基因质粒的接受菌E. coli ，经过含ampicillin的LB培养基孵育1h，采集拉曼光谱并统计C-D比率。每个点对应一个拉曼结果。阈值6.4%为未经过D标记的抗性转化子的C-D比值的平均值+3倍标准偏差；（b）PCR产物（针对质粒上bla基因）的电泳结果，1-3道为高C-D比值的敏感接受菌，4-6为小于10% C-D比值的耐药接受菌，7为不含质粒的E. coli DH5α，8为含bla基因的E. coli DH5α-Ampr；（c）质粒（携带bla基因）的转化频率（线）以及转化频率的标准偏差（柱）。利用单细胞Raman-rD2O方法对不同拉曼图谱采集个数下结果进行了统计。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 通过单细胞Raman-rD2O评价复杂环境中质粒介导的eARGs转化现象 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 作者提取了土壤中的质粒并与E. coli共孵育。通过单细胞Raman-D2O，分析了不同抗生素下（meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin）的拉曼C-D比值。从图 4a可以看出，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin组出现了水平基因转移现象。考虑到土壤等环境中质粒对受体微生物增殖能力的影响，不同质粒编码导致同一抗性等问题，作者引入了传播效率（Spread Efficiency = 转化菌个数/拉曼采集总数）来评估传播风险。就图 4b结果来说，传播效率ampicillin（1.5 × 10 sup -1 /sup ） & gt cefradine（8.6 × 10 sup -2 /sup ）和ciprofloxacin（6.7 × 10 sup -2 /sup ） & gt meropene（0）m和 vancomycin（0）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 作者同时计算了Raman rD2O方法的转化效率，ampicillin (1.9 × 10 sup -3 /sup )& gt ciprofloxacin (5.9 × 10 sup -4 /sup ) and cefradine (8.8 × 10 sup -4 /sup ) & gt meropenem and vancomycin (0) 。而传统平皿培养方法下的转化效率数值小于上述80-100倍。传统方法低估了HGT的程度，一方面存在携带抗性基因但在极端环境下不可培养鉴定的微生物（viable but nonculturable，VBNC），另一方面存在接受质粒导致扩增速率大幅降低（1000倍）的微生物。而在传统方法中过夜培养后，这种差异变得更加的明显。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/59c22524-2c5b-489a-8645-ba9dd52fd408.jpg" title=" 005.jpg" alt=" 005.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 图4 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图 4. （a） E. coli DH5α（敏感对照）C-D比值，以及接受菌E. coli 的C-D比值。接受菌经同位素D预标记后，与从土壤提取质粒进行共孵育。后分别在meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin条件下孵育1h。每一个点对应一个单细胞拉曼图谱。C-D比值小于6.4%的为不带D标记的耐受转化子；（b）携带抗meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin基因的质粒的传播效率。星号表示比较具有统计学意义（单因素方差分析ANOVA，P& lt 0.001）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 0, 0) " strong 【结论 span style=" text-indent: 2em " 】 /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 利用单细胞拉曼反向D2O检测方法能够可靠且快速的从表型上追踪耐药从环境到临床的扩散。方法具有很高的灵敏度，能够在大量受体菌种识别出那些少量的抗性转化子。单细胞水平的检测避免了繁琐的培养过程，可以直接计算传播效率，能够表征临床相关抗生素的不同风险。该方法后续未来可用于破解影响抗性质粒转移以及持续的因素。通过与基因型研究的联系，能更好的理解环境质体（environmental plastidome）传播风险。也是一种研究HGT机制的新手段。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 关于作者 /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 134px height: 170px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/698827c5-ef1f-459f-935d-7b76ee9361ab.jpg" title=" 459b1093-fe12-4d67-bfb0-17b9f500ce02.jpg" alt=" 459b1093-fe12-4d67-bfb0-17b9f500ce02.jpg" width=" 134" height=" 170" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 崔丽 (Li Cui)，研究员，博士生导师，国家优秀青年科学基金获得者，中科院青年创新促进会会员。2002年获厦门大学化学系学士学位，2008年获厦门大学理学（物理化学专业）博士学位。2008.9-至今在中科院城市环境研究所工作，2010. 10评为副研究员，2019.01评为研究员。英国牛津大学（2015.8-2016.2），兰卡斯特大学（2015.2-2015.7）和瑞士伯尔尼大学访问学者（2009.11-2010.2）。至今已在化学和环境国际主流刊物J. Am. Chem. Soc., Anal. Chem.（7篇）, Environ. Sci. Technol., Water Res，J Mem Sci, Soil Biol. Biochem，J Phys Chem等发表论文45篇。先后承担国家自然科学基金项目5项，科技部项目1项，省市基金3项。 strong 研究领域： /strong 环境分析化学（微生物为主），尤其是利用单细胞拉曼/表面增强拉曼光谱，并与稳定同位素标记技术联用，开展环境微生物的研究，如抗生素抗性、氮磷微生物利用过程、生物膜、纳米毒性等。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 关于长光辰英 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 长春长光辰英生物科学仪器有限公司（长光辰英科仪，Hooke Instruments）成立于 2017年，坐落于风景秀美的塞外春城长春，由海外归国团队、长春奥普光电技术股份有限公司（上市公司）、上海合森生物科技有限公司和自然人等股东投资设立的高技术企业，注册资金 3350 万人民币，拥有自主知识产权，主要开展光学、生物学、医学等领域科学仪器的研发、生产、销售及技术服务等工作。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 387px height: 272px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/3d0c783e-ca60-46fb-9bd0-1d6225cdfed8.jpg" title=" hooke instruments 长光辰英-仪器信息网.jpg" alt=" hooke instruments 长光辰英-仪器信息网.jpg" width=" 387" height=" 272" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em " 辰英科仪自主研制的单细胞分选仪PRECI SCS具有独特的可视化分选功能，所见即所得，精准实现目标细胞的逐一分离。采用独特的激光与物质相互作用原理，对于复杂生物样本中形态各异的细胞，可实现非标记状态下的精准分离。对于百纳米级的单个微生物细胞也同样适用。 /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/1d280178-fb1f-4040-bbbc-fa069b8e6821.jpg" title=" 006.jpg" alt=" 006.jpg" / /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " strong 图5. 单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 343px height: 196px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202012/uepic/571c4847-8a4f-4ce9-a1ca-cf9eeabdab49.jpg" title=" 微信图片编辑_20201216145515.jpg" alt=" 微信图片编辑_20201216145515.jpg" width=" 343" height=" 196" / /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " strong 图6. 拉曼单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS-R300 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " PRECI SCS具有可视化、精准、广泛适用等特点。分选过程不依赖标记，可与形态、拉曼、荧光等多种识别方式结合，多种机型可选，满足不同应用需求。搭载潜心研制的HOOKE IntP智能软件，实现单细胞图像智能识别、一键自动分选、全自动细胞获取等。设备操作流程简易，为单细胞测序、未培养微生物开发、工程细胞筛选、细胞图谱绘制等研究提供完美解决方案，助力前沿科学研究。 strong span style=" font-size: 14px color: rgb(165, 165, 165) " （文源：长光辰英） /span /strong /p