蛋白电泳分析仪

p 　　近日，浙江大学方群教授研究组研制出一台可完全手持并独立工作的高速毛细管电泳分析仪，这是迄今为止国际上尺寸最小的基于激光诱导荧光检测的高速毛细管电泳分析仪，该成果以“A Low-Cost Palmtop High-Speed Capillary Electrophoresis Bioanalyzer with Laser Induced Fluorescence Detection”为题发表在学术期刊“SCIENTIFIC REPORTS”上，并得到separationNOW.com网站的亮点报道。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/e0f43721-a7ac-462c-94aa-a0fb41e09f23.jpg" title=" 1_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 掌上高速毛细管电泳生化分析仪外观 /strong /p p 　　高速毛细管电泳(High-speed capillary electrophoresis, HSCE)技术自1991年被提出以来，因其快速、高效又耗样量少的特点，在分析化学领域得到快速发展。近年，即时检测(Point-of-Care Testing, POCT)、环境监测、现场勘查和空间探测等领域的发展对分析仪器的微型化和自动化水平提出了更高的要求，借助于微流控技术的发展、电子元件的集成，小型化也成为HSCE系统的一个重要发展方向。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 麻雀虽小五脏全，极简策略显神通 /strong /span /p p 　　这款掌上HSCE分析仪整体尺寸仅为90 mm× 75 mm× 77 mm(长× 宽× 高)，重300 g，成本只有约3500元。体积虽小，但内部却集成了缺口管阵列自发进样模块、毛细管电泳模块、正交型激光诱导荧光检测模块、高电压模块及电子电路控制模块这五大部分。在该仪器研制过程中，采用了“极简微型化”的策略，即基于对仪器分析原理的本质化理解和前期基础研究的成果对仪器进行最大程度的简约化系统设计，保留核心功能，删减暂不必要的次要功能，同时充分借用其他学科领域内低成本的商品化元器件构建仪器系统，达到简化系统结构、缩小仪器体积、大幅降低仪器成本的目的，同时在分析性能上仍可达到与常规分析系统相当的水平。 /p p 　　该研究组之前发展的具有自主知识产权的缺口管阵列自动进样技术、皮升级平移自发进样技术、斜45° 检测正交型激光诱导荧光检测技术等，为微型化HSCE分析仪的研制提供了坚实的基础。而极简微型化策略和低成本元器件的采用，以及对仪器电子电路的最大程度的集成与优化共同促进了这款微型化仪器的出台。利用在淘宝网上购买的数码相机自动对焦模块中使用的微型平移台，以及200 μL离心管，即可构建一个自动化的缺口管阵列自动进样系统，体积仅为传统平移台系统的百分之一，其移动距离可达到17 mm，定位精度达到10 μm，而其成本仅为20元。 /p p 　　在激光诱导荧光检测模块研制过程中，虽然遵从极简微型化策略而使用了小体积的405 nm激光二极管光源、光电二极管检测器和聚焦透镜，但通过采用独特的斜45° 正交型光路以及对系统的深入优化和挖掘潜力，仍能保留较高的仪器检测性能，在S/N=3的条件下，对荧光素纳的检出限达到1.02× 10-9 M，足以与部分使用光电倍增管的常规激光诱导荧光检测器相媲美。此外，通过采用自主设计和加工的整体型光路框架可将激光光源、激光聚焦透镜、毛细管支架与对准装置、荧光收集透镜、荧光滤光片、光电检测器等元件集成于一体，使得整个检测模块的体积仅为44 mm× 42 mm× 40 mm。 /p p 　　在毛细管电泳分离部分，利用缺口管进样系统和平移自发进样方法可实现90 pL的微体积进样，即不需采用昂贵和加工复杂的电泳芯片，只采用普通的短毛细管即可完成高速毛细管电泳分离操作。同时，利用微型化的高电压模块(22 mm× 22 mm× 22 mm)，可提供0 至 - 6000 V 的电泳电压。 /p p 　　熟悉分析仪器研制的人都知道，要实现分析仪器的微型化，仪器的电子控制系统是关键难点之一，电子控制系统需要实现荧光信号的实时采集和处理、图谱的实时显示及数据的保存。更为重要的是，要实现真正的掌上型应用，整个系统需要由小体积的电池供电，而分析仪中的激光二极管、微型平移台和电泳高压模块对电池来说均是耗电的大户。因此，系统除了选用超低功耗嵌入式微控制器实现了控制系统的集成化外，在降低功耗方面还做了很多努力，最终成功实现了仪器的电池供电，单块容量为1150 mA的锂电池可提供10小时以上的连续工作时间。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/e0cc5945-dcd7-4c82-9acb-302624aceeb3.jpg" title=" 2_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 掌上高速毛细管电泳生化分析仪内部结构照片 /strong /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 分离模式多样化，仪器应用尤可期 /strong /span /p p 　　该掌上HSCE分析仪以3.8 cm的毛细管作为分离通道，仅用7秒的时间即可完成3种氨基酸的电泳分离，在如此短的时间内不会形成明显的焦耳热效应，电泳分离可获得约1 μm 塔板高度的高分离效率。这台掌上HSCE不仅适用于氨基酸的毛细管区带电泳分离，也实现了手性氨基酸(D、L-亮氨酸和D、L-天冬氨酸)的胶束电动毛细管色谱快速分离，还实现了5 个DNA片段、3个蛋白质的毛细管凝胶电泳分离。该仪器还被应用于KRAS原癌基因诊断中的PCR产物和酶切产物实际样品的分析。电泳分离图谱直接显示在仪器外壳上的液晶显示屏上，并同步保存在MicroSD数据存储卡上，也可以通过蓝牙模块无线发送到手机或者平板电脑上进行实时监测。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/d29702a5-d745-4964-87df-547353e8c955.jpg" title=" 3_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 掌上高速毛细管电泳分析仪在线分离结果照片 /strong /p p 　　纵观当下的需求和这款掌上HSCE分析仪的性能特点，该仪器作为一个起点，将有助于开拓HSCE更多新的应用领域：几分钟的DNA片段分离有望取代繁琐耗时的平板凝胶电泳，在广大生化实验室中得到普及 用价廉易得的低成本毛细管取代电泳芯片，自动化的操作和四按键的便捷控制成为走进家庭的敲门砖，进而实现个体化健康管理和疾病预防 电池供电超长待机，这是一款行走的HSCE，借此进行床旁检测、传染病监控等指日可待。 /p p 　　该论文的第一作者为浙江大学化学系微分析系统研究所潘建章副研究员、方盼博士和方晓霞博士，通讯作者为浙江大学化学系微分析系统研究所方群教授。特别感谢国家自然科学基金(21435004，21227007和21027008等)对该项工作的支持! /p p 　　SCIENTIFIC REPORTS文章链接： /p p 　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-20058-0 /p p 　　separationNOW.com报道链接：http://www.separationsnow.com/details/ezine/161ada26e8d/Cheap-analysis-in-the-palm-of-your-hand-A-miniature-CE-device-made-with-off-the-.html /p

毛细管电泳技术在蛋白药物研发和质量控制中的发展 随着蛋白药物的开发热潮在全球兴起，毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）作为一种新兴的研发和质控的分析技术也越来越受到各大生物制药公司的青睐和法规机构的重视。全球大部分生物制药公司均已使用毛细管电泳系统用于蛋白药物的研发及质量控制分析。从培养基优化、克隆筛选、配方稳定性研究和纯化过程监测，到蛋白表征、相关杂质检测、蛋白结构鉴定和蛋白质药物产品的质量控制，蛋白药物的各个环节都需要使用到毛细管电泳。例如蛋白的纯度测定，已经从SDS-PAGE转变为十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳（CE-SDS）方法；蛋白质的等电点测定，毛细管等电聚焦(CIEF)比传统胶条方法更为准确；糖蛋白药物的糖基异质性表征，毛细管电泳是高分辨率分析方法之一。在各国药典中，毛细管电泳技术用于蛋白药物的检测方法也不断丰富与发展。药典中最早出现其对蛋白药物检测方法是促红细胞生成素(EPO)的糖异构体测定。糖蛋白的异构体差异小，普通的分析方法很难将EPO中的多种异构体分离定量。欧洲药典和美国药典将毛细管电泳方法确定为EPO异构体分析的标准，解决EPO产品中各种糖基化异构体的分离和定量问题。此外，生长激素的相关杂质检测标准也采用了毛细管电泳的方法。对于单克隆抗体药物的分析，在2006年，由惠氏、安进、基因技术、礼来、辉瑞、强生及加拿大卫生署等十几个实验室对“CE-SDS方法对单抗药物纯度分析”进行了联合验证。他们对方法的稳定性、可靠性、准确性等多方面进行了研究和考察。研究结果表明CE-SDS方法比传统的SDS-PAGE更适合单抗药物的表征与质量控制，其结果的稳定可靠性要远远超过SDS-PAGE，建议各生物制药公司使用CE-SDS代替原有的SDS-PAGE作为研发与质量分析的平台。随后，上述生物制药公司及机构又针对“CIEF方法进行单抗药的等电点测定及电荷异质性分析”、“CZE方法快速分析单抗药的电荷异质性”，“毛细管电泳技术进行单抗药中的糖基分析”进行了多实验室联合验证，结果展现了CE技术用于单抗药质量控制的优势及可行性。美国药典于2013年发布了利妥昔和曲拓珠等单克隆抗体药物的纯度检测、等电点/电荷异质性分析和糖基分析采用毛细管电泳方法。在中国，中国食品药品检定研究院于2012年联合国内外生物制药机构对“CE-SDS方法对单抗药物纯度分析”进行了验证，确认了CE-SDS方法在分辨率、定量准确性及自动化程度等方面的优势，并指出CE可以对单抗非糖基化重链进行准确定量。基于以上工作以及毛细管电泳技术在单抗药分析中的强大优势，中国药典2015版的第三部中增加了CE技术，明确了CE是单克隆抗体药物大小变异体、电荷变异体、鉴别与一致性和糖基化修饰分析中的重要方法。随着CE技术在生物制药领域的快速发展，以及新的蛋白质药物的不断上市，将会有更多的CE方法出现在各国药典中。毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用（1）单克隆抗体药物的纯度及大小异质性分析SDS-PAGE方法对单抗药物进行纯度分析，在分辨率、定量准确性和自动化程度上，已经不能满足生物制药研发和质量控制的要求。CE-SDS方法基于蛋白分子量的差异分离，用于还原和非还原单抗药物的纯度分析，免去了复杂的人工操作、定量更加准确，具有更高的分辨率，在还原模式中可对非糖基化重链进行分离和准确定量。图1. CE-SDS对还原单克隆抗体药物的纯度分析[1]选用不同的毛细管长度，可以实现高分辨率模式和快速模式的纯度分析。高分辨模式的CE-SDS方法提供最高的分辨率，快速模式的CE-SDS方法提供更短的冲洗和分离时间，提高了分析的通量。CE-SDS结合激光诱导荧光检测器（CE-SDS-LIF），通过5-Tarma或FQ染料对蛋白进行标记，可以获得更高的灵敏度，可以检测到含量在0.01%的杂质碎片。此外，LIF检测器的使用，可以最小化基线波动，使积分和定量更加准确。（2）单克隆抗体药物等电点的测定和电荷异质性的分析单抗药物在结构上会发生糖基化、脱酰胺化、异构化、氧化等翻译后修饰，造成蛋白表面电荷的改变，引起单抗的电荷异质性。每个变异体具有不同的等电点。基于等电点分离的毛细管等电聚焦技术(cIEF)，可以对单抗药物的变异体进行高分辨率的分离和定量，可分离0.03个pI差异的变异体。方法使用等电点Marker制作校准曲线，对变异体的等电点进行准确的测定。是单抗药物等电点测定和电荷异质性分析的重要方法。图2. CIEF方法对单克隆抗体药物的等电点和电荷异质性分析[5]针对不同pI范围的蛋白样品，可以通过选用适当的两性电解质来实现高分辨率的分析。如对于大部分单抗，其pI值位于7-10之间，可使用pH 3-10范围的两性电解质；对于pI 在5-7范围内的蛋白样品，可使用pH 5-8的窄范围两性电解质；而对于pI 小于5的酸性蛋白，则可以使用反向聚焦和迁移模式，实现更好的分析。 （3）CZE方法对单克隆抗体药物电荷异质性的快速分析毛细管区带电泳（CZE）基于分析物电荷/体积的比进行分离，是毛细管电泳技术中最简单、快速的模式。由于单抗药物的各个变异体分子体积近乎相同，因此在CZE分离模式中，电荷变异体的分离取决于表面电荷的差异，与CIEF模式的变异体分离相一致。因此，CZE成为快速电荷异质性分析的平台方法被生物制药行业所使用。此外，由于CZE方法简单快速的特点，它也被用于单抗药的鉴别分析中。图3. 同一种CZE方法对23种单抗药物的电荷异质性分析[3]（4）单克隆抗体药物的糖基异质性分析单克隆抗体等糖蛋白药物中，糖基的种类和排列顺序会导致糖基异质性。单抗药物的糖基化修饰对其安全性和药效有着很大的影响。因此对糖基异质性的质量控制十分重要。毛细管电泳方法对糖基异质性分析的流程包括糖蛋白中糖基的释放、糖基的标记和毛细管电泳分离。磁珠辅助的糖基释放和标记，使得前处理可在1小时内完成，加快了前处理的时间。采用APTS作为荧光标记物，不仅可以通过增加电荷提高分离效率， 还通过LIF检测实现了高灵敏的糖基分析。毛细管电泳技术对糖基分析的优势在于分辨率高，速度快。不但可以区分出一个糖基的差别，相同分子量的糖基异构体也可以得到分离，整个分离过程可在5-20分钟内完成。图4. CE-LIF方法对单抗药糖基分析的电泳图毛细管电泳技术在重组蛋白类药物分析中的应用重组人促红细胞生成素（rhEPO）是高度糖基化的蛋白药物。糖基化的异质性导致了多种变异体的存在。采用CZE方法可对EPO的变异体进行分离和定量，该方法已经成为欧洲药典中EPO变异体分析的标准方法。此外，CIEF方法也可以实现对EPO中各个变异体的高分辨分离，不但可以获得与CZE方法相同的变异体数目和定量信息，还可以提供每个变异体的精确的等电点数值。在对不同来源的EPO产品与参考品的比较中，可使用等电点对变异体进行鉴定。图5. CZE方法对EPO变异体的分析重组人生长激素（rhGH）的纯度及异质性分析中，CZE方法分离度高、定量准确，也已为欧洲药典所采用。图6 CZE方法对rhGH的电荷异质性分析总结在蛋白药蓬勃发展的今天，毛细管电泳技术以其分辨率高、模式多等优势，在蛋白药研发和质控的过程中起到了不可或缺的作用，被越来越多的企业和监管机构所认可，用于蛋白药的纯度、等电点及电荷异质性、糖基等分析中。随着蛋白药物、细胞/基因治疗以及新型疫苗等生物制品的不断发展，毛细管电泳技术将会具有更大的应用空间，在蛋白、核酸及病毒颗粒等分析中，发挥它的优势，提高生物制品的质量控制标准。

1月17日，安捷伦宣布在第23届 PepTalk 会议期间正式发布用于蛋白质分析的新型自动化平行毛细管电泳系统——Agilent ProteoAnalyzer系统。这款新平台简化并提高了复杂蛋白质混合物的分析效率，而这项分析则是制药、生物技术、食品分析和学术界分析工作流程的核心。第 23 届PepTalk会议于当地时间1月16日至19日在美国加利福尼亚州圣地亚哥举办。毛细管电泳 （Capillary Electrophoresis ，简称CE）可提供快速的高分离度分析，且样品消耗量极少，因此已成为蛋白质分离不可或缺的工具。生物制药公司对单克隆抗体以及具有潜在治疗意义的其他蛋白靶点的兴趣日益扩大，因此推动了CE解决方案需求的预期增长。用于蛋白质CE-SDS分析的Agilent ProteoAnalyzer系统外观Agilent ProteoAnalyzer系统具有更高的效率、多功能性和可靠性，尤其适用于蛋白质QC工作流程。自动执行分离、数据处理和简化前处理步骤，从而简化分析工作流程，提高效率，降低培训和相关人力成本。该系统还可以分析从粗裂解物到纯化组分的多种样品类型。它可以在单次运行中分析不同大小和类型的蛋白质，并始终提供准确的结果，减少了耗时且昂贵的重复分析。安捷伦副总裁兼生物分子分析事业部总经理Knut Wintergerst表示：“Agilent ProteoAnalyzer系统将蛋白质分析的效率、多功能性和可靠性提升至新的水平。自动化平行毛细管电泳可简化复杂混合物的分析，使从制药到学术界的各个领域均受益良多。兼具出色的精密度和可靠性，可降低人工成本，并改进分析工作流程。”安捷伦整合基因组学事业部产品经理 Kyle Luttgeharm 将于当地时间1月18日（周四）中午12:25在PepTalk 举办研讨会，主题为《了解 ProteoAnalyzer 系统：独树一帜的自动化蛋白质分析》。安捷伦是CE市场的领导企业之一，其自动化电泳系统广泛应用于核酸分析，如NGS QC和IVT RNA应用。安捷伦希望通过扩展适用于相关生物分子类别的ProteoAnalyzer CE产品组合，巩固其作为质量控制分析解决方案主要供应商的市场地位。