低频细胞活水仪

CRISPR-Cas9技术彻底改变了基础生物研究和应用生物技术的许多领域。但在临床基因治疗实施中脱靶效应的检测仍然存在难题。德国汉堡大学-艾本多夫医学中心（UKE）干细胞移植、细胞和基因治疗研究所的学者们近日在知名杂志《Molecular Therapy》上发表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了称为LATE（长期不良治疗效果鉴定检测）的新型检测方法，该方法使用Stilla naica® 微滴芯片数字PCR系统检测低频的脱靶事件，且有助于分析Cas9脱靶切割效应的影响，并可在单细胞层面进行评估。为了证明LATE方法有助于检测Cas9脱靶切割后的功能影响，研究人员进行了小规模的原理验证实验：明星基因TP53基因敲除后会导致细胞表现出相对生长优势，这是主要的致瘤性标志之一，因此可以作为验证“LATE”检测脱靶能力的指示。本文选取TP53进行CRISPR靶向实验，并转染到有限稀释后的原代人类新生儿包皮成纤维NUFF细胞中，通过“LATE”方法重复检测到低频(图 1. LATE检测原理LATE检测的原理包括 (1)用编码荧光蛋白、设计的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒载体转导原代人类新生儿包皮成纤维细胞 (NUFF)，(2) 使用流式细胞术分析转导率并连续监控长达10周，(3)读取结果，随着转导细胞数量的增加，作为基因组编辑效应的细胞获得生长优势在这一过程中，“LATE”读取到的阳性结果（获得生长优势的细胞）会不会由TP53以外的基因被“脱靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突变，例如插入诱变从而导致细胞获得生长优势呢?为了研究“LATE”检测的阳性结果与TP53插入缺失之间的联系，研究人员设计了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）实验，即Drop-Off分析方法，该方法可以量化gRNA结合位点以及脱靶位点的插入缺失频率。图2. NUFF细胞获得的生长优势与TP53中的插入/缺失频率相关 (A)TP53外显子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX标记探针的示意图。(B) TP53插入/缺失频率，数据由GFR-dPCR测量获得。(C) 脱靶TP53插入/缺失频率，由GEF-dPCR测量获得。对于TP53 gRNA结合位点的检测，GEF-dPCR使用两个双标记水解探针，一个HEX标记探针与远离gRNA识别序列的区域结合，易发生插入缺失的位点设计FAM标记的探针（图2A）。文中使用Stilla naica® 微滴芯片数字PCR系统进行GFR-dPCR方法检测，实验方法详见原文第12页。随后进行Stilla naica® 微滴芯片数字PCR系统检测，结果显示随着时间的推移，TP53插入缺失的频率随之增加，转导后第7天插入缺失率为1%–22%，在52天后达到44%–85%的峰值，该变化趋势和细胞获得生长优势的趋势一致。（图2B）研究人员还对TP53脱靶位点的插入缺失频率进行了检测（图2C）。上述dPCR检测结果也与NGS测序方法和RGB荧光标记方法一致，从而说明“LATE”能够检测TP53介导的gRNA的不良脱靶效应，但这些gRNA并没有被常用的在线预测工具标记为“危险信号”。随后，作者还验证了“LATE”可用于任何类型的设计核酸酶以及不同的CRISPR/Cas变体，并且可以扩展用于其他细胞类型，尤其是高度相关的原代hMSC。因此，“LATE”实验方案可用于验证特定细胞类型中特定设计核酸酶的脱靶效应的影响。图3：LATE检测可应用于hMSCs和h-TERT永生化细胞综上，“LATE”可以作为一种简单、快速和经济的技术手段，用来评估CRISPR/Cas系统带来的生理“副作用”影响，辅助临床前的安全性研究，是对基于NGS的全基因组脱靶检测方法的有效补充，特别是补充了流式和数字PCR的检测结果。原文:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.07.004期刊介绍：《Molecular Therapy》是美国基因治疗学会(ASGT)的月刊，是基因转导、载体开发与设计、干细胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的开发、细胞疗法、疫苗开发、临床前目标验证、安全性/有效性研究和临床试验等领域的领先期刊。《Molecular Therapy》致力于促进遗传学、医学和生物技术的科学发展，影响因子为6.698。

中国科学技术大学郭光灿院士团队在基于里德堡原子的低频射频电场测量上取得重要进展。该团队史保森、丁冬生课题组利用非共振外差方法实现了基于里德堡原子的低频射频电场精密探测，相关成果以“Highly sensitive measurement of a MHz RF electric field with a Rydberg atom sensor”为题发表在国际应用物理期刊《Physical Review Applied》上。 　　里德堡原子由于其较大的电偶极矩和极化率等独特性质，在微波测量领域展现出巨大应用潜力。基于里德堡原子的量子传感器在测量精度﹑抗干扰性以及可朔源等方面有望超越传统微波接收系统，因此该研究方向受到广泛关注，例如：美国陆军研究室、桑迪亚国家实验室等开展了相关研究，并取得了重要进展[Physical Review Applied 13, 054034 (2020)，Physical Review Applied 15, 014047 (2021)]。尽管里德堡原子传感器在GHz高频微波频段探测取得了重要进展，但在MHz附近的低频波段却遇到困难，测量灵敏度较低，其主要原因在于低频电场与里德堡原子之间的耦合是一种弱的非共振相互作用，受限于光谱测量分辨率，人们难以测量微弱微波电场造成的扰动，这就限制了里德堡原子微波测量向低频波段的扩展。 　　在本工作中，研究团队基于AC Stark效应和非共振外差技术，通过引入一个本地振荡电场来放大系统对微弱信号电场的响应，最后通过测量探测光的电磁诱导透明光谱得到信号电场的强度。研究团队实现了对30-MHz微波电场(波长近10米)的高灵敏度测量，最小电场强度为37.3µV/cm，灵敏度为−65 dBm/Hz，动态范围超过65 dB。此外，研究团队还演示了1 kHz振幅调制(AM)信号的传输和接收：通过对探测光束信号进行解调，并分别方波和正弦波调制下提取初始调制信息，保真度均达到98%。图1 (a)里德堡态激发 (b)传感器示意图图2 (a)系统灵敏度 (b)和(c)AM解调信号演示 这项工作提高了MHz电场的原子传感器灵敏度，有助于原子电场传感技术的发展。该工作对里德堡原子传感器的在其他领域的应用，如远程通信、超视距雷达和射频识别(RFID)也有参考价值。 　　中科院量子信息重点实验室硕士研究生刘邦为本文的第一作者，丁冬生教授、史保森教授为本文的共同通讯作者。该成果得到了科技部、基金委、中科院、安徽省重大科技专项以及中国科学技术大学的资助。

为促进电子显微学研究、电镜应用技术交流，打破时空壁垒，仪器信息网邀请电子显微学领域研究、技术、应用专家，以约稿分享形式，与大家共享电子显微学相关研究、技术、应用进展及经验等。同时，每期约稿将在仪器信息网社区电子显微镜版块发布对应互动贴，便于约稿专家、网友线上沟通互动。专家约稿招募：若您有电子显微学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：yanglz@instrument.com.cn）。本期将分享张承青老师为大家整理的关于电镜实验室环境对电镜的影响的系列约稿经验分享，以下为系列之六，以飨读者。（本文经授权发布,分享内容为作者个人观点, 仅供读者学习参考,不代表本网观点）系列之六 低频振动环境改善《外部振动对电子显微镜的影响及处理》一文第一稿于2010年1月完成，本篇主要内容来自该文。以前从未署名投稿，本次做了一些补充修改，第一次署名。还是怕产生误解，再说明一下吧。首先我们来探讨一下电镜实验室低频振动的形成原因。在室外，如马路上、室外篮球场、操场等环境本人都曾经尝试过检测低频振动并试图发现是否存在共性。遗憾的是，从0到125赫兹频率范围内，1/3倍频程测试的包络线来看，不同的地方基本没有共性，所以结论是：这些室外环境的低频振动主要由环境物理振动产生，包括火车汽车、潮汐海浪、江河水流、远处的地下施工、甚至可能还有地球的物理震动等等。低频振动频率低、波长长，所以可以传递到很远地方而衰减不多。那么，建筑物内的低频振动是不是也是这个原因呢？大量的实测数据却显示建筑物内的低频振动主要不是由某处（不管是不是在同一建筑物内）传递过来的，而是主要由建筑物自身谐振造成的（一开始我自己也怀疑这个观点是否正确，带着疑问又继续收集归纳和总结了一百多个场地测试数据，最后还是只有用“建筑物自身谐振”来解释电镜实验室的低频振动才能说得通。实例1：多次开/关近旁的小型振动源，发现对测试结果基本没有影响，相信是牛顿第二定律F=ma所揭示的客观规律：振动源功率（F）太小，无法撼动数千吨的建筑、不能引发谐振。实例2：（实际上这不是某一次测试，许多次的测试都是同样结论，为叙述方便，都归纳到一个实例中）：哈尔滨某大学一楼（无地下室）、二楼、四楼、六楼和八楼的测试中发现，楼层越高振大；实例3：在苏州某半导体公司厂房内（二楼，该厂房结构粗大，相当结实）做对比测试：分别在柱边、墙边、梁边和房间正中央（该室约六十平方米，接近正方形）测试振动，结果惊讶地发现：基本相同！后来在不同城市不同建筑内测试，情况都是这样！实例4：很多测试都有一个共同结果，就是3～8Hz的振幅包络线产生一个峰值，其它频段则不然（或是没有峰值，或是峰值段无规律）。经向一位退休建筑师请教（当年天天坐公交车上班认识的，祝老先生健康长寿），我们分析是由于我国工民建标准造成，梁柱板墙规格、混凝土砂浆比例、进深开间配筋等等，这些因素致使3～8Hz的谐振构成谐振峰！实测数据还推翻了之前我以为房间中间振动会比其它地方大的错误认识，并且进而得出“低频微振是整个楼房的谐振”这一推论。在所谓“条式楼”的测试中也多次发现沿楼房长轴方向的水平振动，明显会比短轴方向小；实例5：在某大学一楼（无地下室）、二楼、四楼、六楼和八楼的测试中发现，楼层越高振大；结论：多次测试结果都证明，低频振动主要是由该建筑的谐振造成。中国的工民建规范基本一致（层高、进深、开间、梁柱截面、墙、地梁、筏板，等等），虽然有差别，但是不大，特别是对于低频谐振来说，大致可以找到共性。一般来说有如下规律：1.建筑平面形状为条式和点式的建筑，其低频谐振都比较大；其它如工字型、王字形、L形、八字形、H形、口字型、日字形等等低频谐振都较小；2.最常见的条式楼里沿长轴方向的振动往往明显比短轴方向小；3.同一建筑内，没有地下室的一楼振动最小，楼层高越高振动越差，有地下室的一楼振动与二楼接近，地下室最下层振动最小；4.垂直方向的振动比水平方向大且与所在楼层无关（当然是在同一楼层测试比较）；5.楼板越厚，则振动的垂直方向与水平方向相差越小（我曾经多次从测试数据成功推测出楼板厚度），绝大多数情况下振动的垂直方向比水平方向大；6.除非有某个大型振动源，同一层建筑的振动都基本相同，无论是房间中间，或者是靠近墙边、靠近柱子、横梁上方等各处，都基本一样（注意，即便在同一位置不动、间隔几分钟再测试，极可能数值都是不完全一样的，个别频点可以相差百分之五十以上）。好了，既然我们现在明白了低频振动的来源和特点，那就可以有针对性的采取改进措施和提前预估某环境的振动情况啦。由于改善低频振动成本较高，有时受环境条件限制，某些方法完全不能应用（参见下面的讨论），所以实际工作中，经常是选择/更换较好场地做电镜实验室来得事半功倍。下面我们讨论一下低频振动的影响和解决方案。20Hz以下的低频振动对电子显微镜的干扰影响很大，参见以下两图。图一 图二图一与图二是由同一台扫描电镜拍摄的高分辨图像（均为300kx）。但是因为存在振动干扰，图一的水平方向（分段）有明显的毛刺，并且图像的清晰度和分辨率明显下降。消除了振动干扰后得到同一样品的图像为图二（有没有“赏心悦目”的感觉？）。如果测试结果表明准备安装电镜的场所振动超标，则必须采取适当措施，否则电镜厂家不能保证电镜安装后的性能可以达到最佳设计标准。一般可以选择混凝土减震台（Anti-Vibration Foundation）、被动式减震器(Passive-Vibration Isolation Platform)、主动式减震器(Active-Vibration Isolation Platform)等几种方法来改善或解决。混凝土减震台需要现场施工，且必须采取特殊方法（底部和周围有弹性软垫层等），一般的土建施工方法有可能反而增加低频（20Hz以下）振动。施工中有大量土建材料进出难免影响周围环境。混凝土减震台的示意图见图三。图三质量在50吨左右的混凝土减震台，其减振效果一般可以达到2Hz以上约-2～-10dB。混凝土减震台的质量越大减振性越好，条件允许的情况下应尽可能大些（经多地多次实测，小于5吨的减震台在1～10Hz低频段内有谐振，反而增大了振动；小于20吨的基本无效，能够起到减振效果的须大于30吨，暂无30～40吨的数据，尽量不要低于50吨；北京某大学一两百吨减震台效果良好；重庆某研究所，地面混凝土直接做在巨大山石上，环境极差，但测得振动值极小）。在被动式减震器中，一般常用的橡胶、钢弹簧、空气弹簧（汽缸）等方式的减震器因为它们在20Hz以下的低频段效果很差，甚至往往由于谐振反而加大了振动，所以不考虑采用。只有磁力减震器的低频效果尚可，但是其性能还是远不如主动式减震器（与混凝土减震台的减振效果相近）。图四是几种减震方式的效果比较。图四 几种减震方式的振动传输特性比较仔细观察图四，我们有以下结论：1．碳素钢弹簧的谐振频率（fh）大约为50Hz，在70Hz以下的低频段不但没有减震效果，反而由于谐振而加大了震动。橡胶垫的fh大约为25Hz，在35Hz以下的低频段不但没有减震效果，反而由于谐振而加大了震动。2．小于5吨的混凝土减震台在10Hz以下有谐振加大振动，还不如不做。3．空气弹簧的fh大约在15Hz左右，在25 Hz以上有较好的减震性，在40 Hz以上有良好的减震性，所以被广泛应用于光学平台等精密仪器设备的减震。但是它在20 Hz以下同样有较大的谐振，所以不宜作为电镜减震的选项（有些电镜内部采用空气弹簧减震，相信那是不得已而为之）。在做低频减震处理时，以上几种减震方式不要考虑选用。4．磁力减震器低频减震效果尚可，要求不高的情况下可以选用。5．各种主动式减震器效果都是相当好的。它们的谐振频率可以低到1 Hz以下，2～10Hz的减震效果可以达到-10～-22dB，非常适用于对低频段减震要求较高的场合。（据说最新科技产品“超级橡胶”有具良好减震性能，看到电视上说已在港珠澳大桥上应用，很想能搞一小块来测试一下是否可以应用在电镜方面，但是朋友答应的样品迄今不见踪影。有人能帮我搞块样品吗？先谢了。）一般我们认为，对于电镜来说20 Hz以下的低频振动影响大并且难以防范。由于绝大多数人不能感受到20 Hz以下的低频振动，所以经常发生明明有较大的低频振动，却因为感觉不到而误认为没有什么振动。被动式减震是利用减震设施的质量、固有振动传递特性等物理性能来达到隔阻和减弱外部振动对电镜的影响。被动式减震器的工作原理可参考图五。图五主动式减震器的工作原理与被动式相比有很大差异。各种类型的主动式减震器工作原理基本相同，都是由一个三维探测器检测到三维方向传来的外部振动后，由PID控制器发出等幅反相的控制信号，再由执行机构产生等幅反相的内部振动来抵消（或减弱）外部振动的干扰。主动式减震器的工作原理可参考图六。图六主动式减震器一般常用的有压电陶瓷式、空气式、电磁式等。它们的区别主要是执行机构不同，而三维探测器和PID控制器基本都大同小异。压电陶瓷式：利用压电陶瓷的晶体压电效应产生等幅反相的三维内部振动。空气式：由PID控制器控制进（排）气阀，连续可控的压缩空气在特殊的汽缸内产生等幅反相的三维内部振动。电磁式：PID控制器分接控制三组电磁铁产生等幅反相的三维内部振动。主动式减震器的减振效果可以达到20Hz以上约-22～-28dB（实测过许多号称可以达到-38dB的，但是，只能说：抱歉）。不同形式的主动式减震器价格亦有较大的差异。各种减震器一般在电镜就位安装之前准备好，与电镜同时安装。另外在某些特定的条件下，减震沟也可以取得较好的减震效果。图七是减震沟有效的情形。图七 图八是减震沟无效的情形。 图八一般来说，减震沟越深减振效果越好（减震沟宽度对减振效果影响不大）。常见的几种减震方法对比参见下表：电镜减震，与处理桥梁、楼宇、风振、地震等有些共通之处，但是区别更大，绝不能生搬硬套。目前国家在低频微震领域还没有必须的相关理论依据、设计规范、设计标准、设计案例、各个工民建设计单位基本都没有配备专业检测仪器，所以，和前面讨论过的低频电磁屏蔽一样，当前没有“有资质的设计部门”来做专业设计。2020.11张承青作者简介作者张承青，退休前在某电镜公司工作多年，曾经做过约两千个（次）电镜环境调查、测试，参与多个电镜实验室设计及改造设计规划，在低频电磁环境改善和低频振动改善等方面有些体会，迄今仍在这些方面继续探索。附1：张承青系列约稿互动贴链接（点击留言，与张老师留言互动）： https://bbs.instrument.com.cn/topic/7655934_1附2：张承青系列约稿发布回顾拟定主题发布时间文章链接序言 电镜实验室环境对电镜的影响2020年10月13日链接系列之一 电子显微镜实验室环境调查的必要性2020年10月15日链接系列之二 电镜实验室的电磁环境改善2020年10月20日链接系列之三 低 频 电 磁 屏 蔽 实 践2020年10月22日链接系列之四 主动式低频消磁系统2020年10月27日链接系列之五 几种改善电磁环境方法比较2020年10月29日链接系列之六 低频振动环境改善2020年11月3日链接系列之七 谈谈电子显微镜的接地2020年11月5日链接系列之八 温度湿度和风速噪声2020年11月11日链接… … … … … … 附3：相关专家系列约稿安徽大学林中清扫描电镜系列约稿