深层肌肉刺激仪

新型芯片复制神经肌肉接头有助于为神经肌病测试药物麻省理工学院（MIT）工程师们开发出一种复制神经肌肉接头（神经和肌肉之间至关重要的连接）的微流控设备（microfluidic device）。该设备约有25美分硬币大小，包含单个肌条和一小组运动神经元。研究人员能够在逼真（现实）的三维基质中影响和观察两者之间的相互作用。研究人员对该设备中的神经元进行基因改造，使其对光照做出反应。通过将光照之间投射到（这些）神经元上，他们能够精确刺激这些细胞，发送信号激发肌肉纤维。研究人员还测量了设备内肌肉在被激发后抽搐或收缩的力量。该研究结果2016年8月3日在线发表于《Science Advances》期刊，可能帮助科学家们理解并识别药物以治疗肌萎缩侧索硬化（ALS，即卢伽雷氏症）和其他神经肌肉相关疾病。“神经肌肉接头涉及许多失能性疾病，其中有些是残酷而致命的，还有很多尚未被发现”领导该研究的MIT机械工程系研究生Sebastien Uzel说，“我们希望能够在体外形成神经肌肉接头，从而帮助我们理解某些疾病活动”。Sebastien Uzel现在是哈佛大学Wyss研究所博士后。自1970年代以来，科学家们已经提出了大量方法在实验室中模拟神经肌肉接头。大部分这些实验涉及在培养皿或小玻璃基板上生长肌肉和神经细胞。但这样的环境与（动物）体内状态相去甚远，在动物体内，肌肉和神经细胞存活于复杂的三维环境中，并且通常距离较远。“想想长颈鹿”Uzel说，“脊髓神经元所发出的轴突需要跨越非常大的距离才能与腿部肌肉连接。”为了在体外重建更逼真的神经肌肉接头，Uzel和同事们构造了一种微流控设备，该设备具有两个重要特性：1. 三维环境；2. 隔离肌肉和神经的隔间，从而模拟两者在人体内的自然分离状态。研究人员将肌肉和神经元细胞悬浮于隔间中，然后充满凝胶以模拟三维环境。为了生长肌肉纤维，研究团队使用了获得自小鼠的肌肉前体细胞，随后将其分化成肌肉细胞。他们将细胞注入微流控隔间，细胞会在隔间内生长并融合形成单个肌条。同样的，他们从干细胞分化出运动神经元，然后将所获得的神经细胞聚合体放置在第二个隔间中。在分化两种细胞之前，研究人员使用光遗传学（optogenetics）技术对神经细胞进行了基因改造。该研究共同作者、MIT机械和生物工程Cecil and Ida Green特聘教授Roger Kamm说：光“能够让你精确控制你想要激活的细胞”。在这样的狭小空间里，电极无法实现这一点。最后，研究人员为该设备添加了另一个特性：力传感。为了测量肌肉收缩，他们在肌肉细胞隔间内构造了两个微小的弹性支柱，位于肌肉纤维周围并能够被生长的肌肉纤维所包裹。随着肌肉收缩，支柱会被挤压在一起，形成位移，研究人员能够测量这些位移并转换为机械力。在测试该设备的实验中，Uzel和同事们首次观察到神经元在三维区域内向肌肉纤维伸展轴突。在观察到轴突建立连接时，他们用微小的蓝光激射刺激神经元，并立即观察到肌肉收缩。“发射闪光，就能观察到抽搐”Kamm说道。根据这些实验，Kamm说，这种微流控设备可能作为神经肌病药物测试卓有成效的试验场，甚至可以根据个体患者进行定制。“你可能从ALS患者获得多能细胞，将它们分化成肌肉和神经细胞，并且为特定患者制造整个系统”Kamm说，“然后你能够根据需要多次复制，同时测试不同的药物或疗法的组合，查看哪种疗法能够最有效地改善神经和肌肉之间的连接。”另一方面，他说，该设备在“建模操作协议（modeling exercise protocols）”中可能是有用的。例如，通过以不同的频率刺激肌肉纤维，科学家们能够研究重复压力如何影响肌肉的性能。“现在，随着所有这些新型微流控方法的开发，你能够开始建立神经元和肌肉的更复杂的模型”Kamm说，“神经肌肉接头是另一个现在可以被纳入测试模式的单位”。

无创检测体内肿瘤病灶对于临床医学肿瘤诊疗至关重要。医学成像技术如计算机断层扫描、核磁共振或正电子发射计算机断层扫描等虽然能诊断体内深层病灶，但存在采集时间长、仪器昂贵或辐射剂量大等原因，更常用于术前检查。与之相比，光学检测和成像方法具有实时、高灵敏、非电离辐射、采集方便等优势，结合外源性造影剂可以提供生物体结构、功能和分子的精确信息，是肿瘤诊断的绝佳工具。但是，现有的肿瘤光学检测技术的进一步发展也面临着瓶颈：组织穿透深度较低，无法检测深层病灶。由于生物组织对光子强烈的散射和吸收作用（如图1），光在生物组织中的穿透深度受限一直是这个领域中的巨大挑战。例如，近红外区域肌肉组织的传输平均自由程只有1~2 mm，目前广泛使用的荧光成像技术的组织穿透深度通常只有几毫米。临床结果发现，基于吲哚菁绿的分子影像无法检测到距离胸膜深度超过1.3 cm的肺结节，容易造成假阴性。图1. 生物组织对光子的散射与吸收表面增强拉曼光谱（SERS）对金属纳米颗粒附近的分子的拉曼信号实现极大地增强，具有高特异性和高灵敏度等优点，非常适合用于生物光谱检测。为了获取更高的检测深度，已经报道了光源和探测器间具有一定空间偏移的空间偏移拉曼光谱装置。它利用了生物组织的高散射特性，即来自深层的光子到达表面时会有更大的横向偏移。空间偏移拉曼光谱抑制了表层的背景信号，因此提高了来自深层信号的信噪比。它的一种特殊形式是透射拉曼光谱，它将激光和拉曼探测器放置在样品的两侧。据报道，透射拉曼光谱技术可以实现具有高组织穿透能力的无创检测。尽管如此，透射拉曼光谱技术的最新水平仍未能满足实际生物医学应用的需求。首先，目前文献报道的透射拉曼光谱技术的检测深度或组织厚度仍远低于与人体相关的厚度值。例如，人类的腹背距离超过10 cm。然而，使用透射拉曼光谱技术穿透超过10 cm厚的体外组织或活体动物的可行性迄今尚未得到证实。其次，光子在透射拉曼检测中的传播过程以及测量因素如何决定信号尚不清楚。透射拉曼信号不仅受组织散射系数和吸收系数的影响，还可能与SERS纳米探针的亮度、病灶埋深、组织总厚度等因素有关。评估这些决定性因素之间的关系至关重要。第三，激光的安全性是光学模态临床转化中一个长期关注的问题。临床激光的光安全性通常由最大允许照射量来评估，即对暴露的身体表面造成损伤的风险可忽略不计的最高激光辐射水平。然而，目前大多数体内SERS研究使用的激光剂量远远高于光安全剂量限值，这在很大程度上阻碍了SERS技术的临床转化。图2. 使用透射拉曼装置和超亮SERS探针对小鼠深部肿瘤进行无创成像（示意图)以及透射拉曼光谱信号的理论计算为了解决本领域的上述重要问题，上海交通大学生物医学工程学院叶坚团队首先从透射拉曼光谱测量过程中拉曼光子传播的理论建模和计算入手，研究了实验参数（组织厚度、SERS纳米探针位置、纳米探针亮度、激光功率和光束尺寸）对透射拉曼光谱探测深度的影响（如图2）。理论计算表明，透射拉曼信号与信号源的埋深之间呈不对称的U型关系，说明病变位于组织中部时信号最弱，对透射拉曼信号的检测是最具挑战性的。而提高SERS纳米探针的亮度是增加检测深度/透射组织厚度最直接有效的途径。此外，光束尺寸的增大对深部病灶的透射拉曼检测强度几乎没有影响。因此，可以采用较大的激光束尺寸来降低功率密度。图3. 扩散光束照明的体外透射拉曼光谱检测基于这些发现，该团队设计制备了超亮SERS纳米探针与自制的透射拉曼装置相结合，开发了一个拉曼检测/成像系统。该系统具有以下优点:（1）深度检测能力，使用了低至单颗粒检测水平的超亮SERS纳米探针 （2）临床光安全，样品表面的激光功率密度低于安全光照剂量阈值。利用该系统，团队成功地在安全光照剂量内通过体外14cm厚的组织实现了对包埋在其中的SERS纳米探针的检测（图3），与目前已报道的透射拉曼光谱检测研究相比，穿透深度提高了约97%。进一步地，团队在安全光照剂量内实现了1.5 cm厚未剃毛活鼠体内深层SERS纳米探针的体内无创成像（图4），相比之下，传统的背散射拉曼成像无法获得显著信号。这项工作为透射拉曼光谱技术在体内非侵入性生物医学检查方面的发展提供了新的见解，证明透射拉曼光谱有望成为未来临床癌症诊断的可行工具。图4. 活体小鼠无创光安全透射拉曼光谱检测

胃肠道（gastrointestinal, GI）所有器官均由胚胎发育过程中源自三原胚层的细胞组装而成，且是正确执行胃肠道复杂功能所必需的。比如说，胃以化学和机械方式分解食物的关键功能取决于内胚层形成的上皮细胞之间复杂的相互作用以产生胃酸和蛋白酶，中胚层发育而来的平滑肌控制缩放，而外胚层而来的肠道神经负责协调前两个过程。近端胃肠道的先天性和获得性疾病包括食管闭锁、胃轻瘫和胃食管反流病，这些疾病可能由上皮、肠道神经系统（enteric nervous system, ENS）或平滑肌发育不当引起。尽管动物模型对于研究胃食管的发育和疾病非常重要，但不同物种在该器官中存在巨大的结构和功能差异，例如啮齿动物就具有人类不存在的前胃，Hedgehog信号在鸡和小鼠胚胎中胃肠平滑肌的发育中也具有不同作用【1】。因此，创建一种可在体外操作的遗传易处理且复杂的人类GI 组织模型可以加速改善胃食管功能药物的开发和研究。然而，当前的胃和食管类器官模型的局限性在于它们仅包含上皮组织【2, 3】，因此，迫切需要在体外整合来自其他两个胚层的祖细胞从而增加食管类器官的复杂性。2021年12月1日，来自美国辛辛那提儿童医院医学中心的James M. Wells团队在Cell Stem Cell杂志上发表了一篇题为 Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells 的文章，该团队开发了由源自人类多能干细胞的三原胚层的细胞组装而成的包含功能性肠道神经元、平滑肌层和分化腺体的人胃类器官，利用该系统证明人类肠神经嵴细胞（enteric neural crest cells, ENCCs）对胃上皮和间充质发育的关键作用，并为其他复杂类器官的开发提供了一个强大的范例。胃肠道发育的第一个，也是最关键的步骤之一是将上皮细胞和间充质组装成原始肠道管。尽管多能干细胞衍生的人胃类器官具有完整的上皮细胞类型，但它们本质上并没有形成强大的间充质【2, 3】。为此，作者根据最近建立的一种方法，直接将人多能干细胞分化为胃间充质细胞的来源，即内脏间充质细胞（splanchnic mesenchyme, SM）【4】，并尝试将间充质纳入胃类器官发育，通过标记物鉴定确认具有间充质包裹上皮的胃窦类器官（hAGOs）生成（图1）。紧接着，作者将有无间充质的hAGOs移植到小鼠体内培养，结果显示约60%没有添加间充质的hAGOs 没能继续生长，即使存活下来也仅有简单的未完全分化的结构，相反，那些具有间充质的hAGOs具有100%的存活率，说明间充质的的掺入能促进hAGOs在体内的生长。图1. 由人多能干细胞衍生hAGO+SM类器官方法示意图需要注意的是，尽管SM能促进hAGOs的生长，但上皮并未发育成类似于人胃的腺体结构。为了解决这个问题，作者基于先前的研究从人多能干细胞中获取ENCCs，将其与hAGOs+SM在体外重组后再次移植到小鼠体内，并惊喜地发现hAGO+SM+ENCCs移植物具有嵌入肠道神经元网络的平滑肌层，且其组织方式类似于人38周的胎儿胃，并包含胃窦细胞类型，比如粘液细胞、表达生长素释放肽、组胺和胃泌素的内分泌细胞等。采用类似的方法，作者还生成了胃底类器官（hFGOs），hAGOs和hFGOs在移植后仍能保持它们的区域特性，通常将人类胃底与胃窦区分开来的细胞类型比例也同样能将hAGOs与hFGOs区分开。从组织结构上来看hAGOs和hFGOs类似于人胃，那么功能上呢？胃对食物的机械分解和十二指肠的排入涉及ENS对平滑肌的收缩控制。作者将从hAGOs分离的组织置于器官水浴系统检测其收缩性，来判断是否存在功能性神经肌肉单位。可以观察到源自hAGO+SM+ENCC的组织存在高度规则的自发收缩振荡，而hAGO+SM的收缩活动则是不规则的。此外，将分离的组织暴露于电场刺激（EFS），仅导致hAGO+SM+ENCC收缩活动增加，表明ENS对平滑肌的调节，如果添加神经毒素TTX阻断ENS功能，也消除了平滑肌的收缩活动。在构建类器官的过程中，作者还发现ENCCs能引起上皮周围的间充质细胞增加2-4倍，且与胃间充质细胞基因BARX1、NKX3-2等的表达水平增加相关，说明肠道神经元在促进对于生成胃特异性间充质细胞。此外，作者将hAGO+ENCC移植到小鼠体内，研究在没有间充质的条件下ENCCs如何影响上皮发育。作者发现，在21个移植物中有5个存在明显的腺上皮形态发生，而19个没有ENCCs的hAGO均未有上皮形态发生，这一发现说明如果没有足够的间充质参与，单独添加ENCCs不会导致正常胃的发育，但也会促进hAGO的存活和部分移植物中腺上皮的发育。然而，这些腺上皮并不表达关键的胃或肠特异性上皮标志物，而与十二指肠近端黏膜下层，靠近幽门连接处的Brunner腺体相似，说明ENCCs需要强大的间充质细胞群来促进胃腺形态发生，即间充质和ENCCs的信号协同作用对于维持胃特征而言十分重要。除了胃窦和胃底类器官，作者还利用上述方法设计了食管类器官，说明通过组合三个胚层祖细胞来设计不同胃肠道器官的可行性，同时也强调了上皮、间充质和ENCCs细胞间通讯对于胚胎器官的正确组装和功能的重要性，为重建先天性GI疾病和上消化道急性损伤模型提供了研究材料。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.10.010