细胞阻抗分析仪

实时阻抗流式细胞分析仪（piRT-IFC）研发进展单细胞电学特性生物传感与分析技术为单细胞生物物理学研究提供了新维度。该技术已被证明在全血分析、肿瘤细胞分型和免疫细胞状态评估方面具有重要的应用潜力。然而，现有的电学检测方法难以实现高通量实时性分析，限制了需要大量系统实验的单细胞电学特性研究的开展。 近日，中国科学院微电子研究所健康电子中心研究员黄成军、副研究员赵阳团队，在单细胞电学特性流式分析方法及高通量实时分析仪器研究方面取得重要进展。该团队提出了快速并行物理拟合求解器，仅需0.62 毫秒即可在线求解出单个细胞膜比电容和细胞质电导率。与传统求解器相比，在不损失准确度的前提下，速度提升了27000倍，且不需要任何数据预采集和预训练过程，进一步实现了基于物理模型信息的实时阻抗流式细胞分析仪（piRT-IFC）（图1）。该技术可在50分钟内实时表征高达100902个单细胞，具有高稳定性、高通量、实时化和全流程自动化等特点。作为示范应用，该团队对药物处理后HL-60中性粒细胞脱粒现象这一典型的快速变化的生物过程进行实时表征分析。与普遍采用的神经网络辅助加速方法对比研究表明，piRT-IFC具有速度快、准确度高和泛化能力强的优势，具备广泛的应用潜力。 相关研究成果以piRT-IFC: Physics-informed real-time impedance flow cytometry for the characterization of cellular intrinsic electrical properties为题，发表在《微系统与纳米工程》（Microsystem and Nanoengineering）上。该研究由微电子所和计算技术研究所合作完成。研究工作得到科学技术部、国家自然科学基金委员会、北京市和中国科学院的支持。近年来，该课题组面对单细胞物理特性检测存在敏感机理不明和技术实现困难等关键技术瓶颈，开创性提出了基于微流控技术的“交叉压缩通道”敏感新原理和单细胞电学模型，建立了基于微流控芯片的单细胞电学特性高通量定量检测方法，检测参数包括细胞膜比电容和胞浆电导率，通量比膜片钳等常规方法高10000倍，并进一步研发出实时高通量单细胞电学特性流式分析仪（图2）。仪器入选中国科学院自主研制科学仪器名录，与首都医科大学宣武医院、首都医科大学附属北京胸科医院、计算所等单位合作，成功用于脑卒中动物模型、癌症病人样本、药物模型等领域的多种细胞的分析，为肿瘤/脑卒中等精准诊断、药物筛选等提供了有力工具，并发现了新型标志物，验证了相关药物候选分子的作用、获得授权专利。论文链接 图1. 实时阻抗流式细胞分析仪（piRT-IFC）原理样机、核心微流控芯片、设备交互界面、典型结果和自动化实时数据处理流程 图2. 基于微流控芯片技术的单细胞电学特性活体单细胞分析仪（左）及核心微流控芯片（右）

本文作者：王文会 清华大学精仪系 长聘副教授王文会，清华大学精仪系长聘副教授，博士生导师，入选国家海外高层次人才引进计划青年项目。主要从事微操作器件和系统、机器人自动化技术、及其在生命科学仪器领域的应用研究工作。项目来源包括国家重点专项、科技创新2030—“脑科学与类脑研究”重大项目、国家自然科学基金仪器项目、面上项目等；在Small，Lab Chip，Small Methods，Biosensors and Bioelectronics，Analytical Chemistry，IEEE Trans等期刊上发表50多篇SCI论文，获得授权发明专利12项（包括2项美国专利）。近年的研究兴趣在于单细胞操控和理化特性表征技术、系统及应用。清华大学王文会教授团队在阻抗流式细胞术上取得系列进展对单细胞生物特性的表征有助于揭示细胞的基本结构、功能信息及其病理状态，基于单细胞的研究可以更深层次揭示生命的本质和规律，对生命科学研究、疾病诊断和个性化医学意义重大。细胞内的生理变化常伴随着化学和物理修饰重组，可以通过生物化学和生物物理的方法对单细胞进行表征。生物化学方法通常利用生化标记识别细胞及其状态，特异性高，但是需要先验知识且检测成本高。而生物物理方法利用细胞的机械、电学等固有表型特征，能够实现对单细胞的快速无创无标记表征，方便对细胞进行后续操作如分选、培养和组学分析等。目前，单细胞生物物理特性表征已有不少经典方法，如原子力显微镜、光镊和膜片钳等，提供了有效的手段，但是这些技术检测流程繁琐、系统复杂且通量低。而作为一种能够精确操控微尺度流体的新兴手段，微流控技术所需样本体积小、生物相容性高且响应速度快，使得其成为当前单细胞研究中不可或缺的工具。微流控技术不断地应用于单细胞生物物理表征。在电学特性方面，研究者已成功利用电旋转、电阻抗谱和阻抗流式技术测量细胞膜电容等电学参数；在机械特性方面，研究者基于诱导变形原理，成功利用光、机、电、声等物理场实现对细胞杨氏模量等机械参数的测量。从Coulter计数器发展而来的阻抗流式细胞术IFC具有通量大的优势，在技术和应用上取得了很大的进展，但在提取单细胞的本征参数方面还存在低效、解算慢、模态单一、准确性未知、易堵塞等问题。基于常用的电阻抗流式器件结构和测量架构（图1），清华大学王文会教授团队近年在解决以上这几个问题方面取得了一系列进展。图1. 阻抗流式细胞术基本架构针对单细胞本征特性是否可用阻抗流式表征的问题，利用最小流阻流体捕获原理（Lab on a Chip, Outside Front Cover, 2021, 2486-2494 Lab on a Chip, Outside Back Cover, 2016, 4507-4511），设计U型微流道结构（图2），可以使同一个细胞以流式流经一组IFC电极后，到达设有另一组EIS电极的捕获点位。在两组电极处分别进行阻抗流式测量和阻抗谱测量，结果发现离散的阻抗流式数据点与阻抗谱数据吻合度极高，在三个量级的流速（10-1000 nL/min）下，其相对偏差5%，证明了阻抗流式术可以替代阻抗谱实现对单细胞阻抗本征参数的提取，同时该结构也允许流式和阻抗谱测量同时进行，实现在通量和准确性上的相互补充（Analytical Chemistry, 2019, 91(23): 15204）。图2. 阻抗流式细胞术与阻抗谱互补针对电学本征参数的计算往往通过复杂的生物物理模型离线拟合，耗时较长，难以满足下游操控分析环节的实时在线需求的问题，提出了神经网络赋能的实时在线电学本征参数提取技术，基于神经网络实现对单细胞电学本征参数的加速求解（图3）。相比传统的梯度拟合计算方法，单细胞事件的推理时间约为0.3 ms，速度提升了10000倍，在实验部署中，电学本征参数测量通量接近100/秒。获得的本征参数用于细胞分类，可将准确率从不到80%提升到93%。通过让同一批细胞来回往复测量区进行十次电学测量，本征参数的变化4%；对细胞的染色与培养表明，细胞仍保持活性且增殖率和控制组的细胞没有特别明显的差别，证明电学表征不会显著影响细胞活力（Lab on a Chip, Outside Back Cover & 2021 Hot Articles, 2022, 240-249）。图3. 神经网络加速求解细胞电学本征参数针对阻抗流式通常只求解电学特性参数的局限，提出基于阻抗数据的电学-机械双模态本征参数提取技术（图4）。利用流道结构和电极的空间耦合以及阻抗测量的高时空分辨率特性，使阻抗信号同时包含细胞电学特性及通过收缩通道过程中挤压的动态形变信息。通过构建电阻抗-细胞形变映射模型，发现测量电阻与细胞伸长量成正比，从而能够将测得的阻抗信号定量映射到细胞机械形变。同时采用分时复用传感策略，利用差分传感信号将电脉冲和幂律时变阻抗信号以分时复用的方式集成，从而实现单细胞电学-机械双模态本征特性表征。在不需要使用相机的情况下，仅使用阻抗数据后，测量的通量大幅提高。通过获得的数据，首次发现1 μM级浓度的细胞松弛素可能是诱导处理细胞骨架发生显著变化的阈值。针对常用的细胞分类任务，基于神经网络利用电学-机械双模态本征参数实现了明显高于基于单一电学特性和机械特性的93.4%高分类准确率，相比电学和机械特性分类准确率的绝对值分别提高了12.3%和5.1%，说明单细胞生物物理特性的多模态测量能够更特异地对细胞进行表型分析（Small Methods, Back Cover, 2022, 6(7), 2200325 Small, Frontispiece, 2023, DOI: 10.1002/smll.202303416）。图4. 使用电阻抗同时求解电学-机械学本征特性参数针对单细胞电学表征准确性未知的不足，利用辛醇辅助脂质体组装方法合成了类细胞大小的脂质体，以脂质体作为单壳模型粒子，结合阻抗测量芯片与测量系统构建了测量平台，提出了单细胞电学模型测量准确性评估和相应的补偿技术（图5）。研究发现，当传感区尺寸接近被测粒子时，通过模型拟合得到的电学本征参数与真值的相对误差小于10%，此时电极间距与流道宽度主要通过影响测量体积分数而对测量准确性产生影响，从而基本验证了单细胞电学测量模型的准确性。但是由于电学测量模型通过对流道中间高度电场强度进行建模计算，共面电极产生的电场在流道高度方向的不均匀衰减将导致流道高度对电学模型测量准确性的影响最大，测量相对误差高达30%（ACS Sensors, 2023, 8(7), 2681–2690）。而这种误差，可以通过在流道中设计合适的电极，将粒子的空间位置与电极上的响应信号对应起来（Analytical Chemistry, Supplementary Cover, 2023, 95(15), 6374-6382）。这样，通过响应信号，推导出粒子的瞬间空间位置，代入对应的电学模型中，即可实现更为准确的单细胞电学特性测量。图5. 合成类细胞脂质体评估电阻抗测量的准确性及位置误差估计针对窄流道电阻抗易堵塞的问题，提出了在阻抗流式术中使用非导电粘性鞘液的方法（图6）。此前的研究还没有搞清使用流道和鞘液在阻抗测量方面的准确性是否有变化，以及使用什么样的鞘液性能更好。因此，首先在流道MC和鞘液SC上下游两处布置了电极测量阻抗，发现文献中报道过的辛醇和去离子水表现不一样，其中去离子水作鞘液时，阻抗准确性降低显著，而辛醇则变化不大。由此推断鞘液-主流道溶液界面的稳定性至关重要。通过使用具有不同粘性的PEG溶液作为鞘液，实验证明粘性越高，鞘液-主流道溶液界面的稳定性越高，准确性越高。此外，PEG溶液还能让阻抗测量的信噪比（1.42x）、灵敏度（7.92x）都有所提升，在半小时的实验中没有观察到堵塞或堵塞的迹象。从获得的电阻抗信号中解算出细胞电学参数，并用于典型的细胞分类应用，其准确度可达93%，与不使用鞘液的阻抗流式取得的最好表现相当（Lab on a Chip, Inside Back Cover, 2023, 23, 2531-2539）。图6. 使用非导电粘附鞘液提升电阻抗测量性能以上这些进展，丰富了阻抗流式细胞术的技术体系，提出的技术和方法对平台的架构关系并不是紧密耦合，其适用性较为宽广，可在阻抗流式细胞术的不同平台实现中灵活选用。致谢：感谢国家自然科学基金的资助，NSFC (no. 62174096, 52105572)。

原标题：清华大学王文会团队: 基于阻抗流式细胞术的单细胞样本“一步式”分选除盐质谱预处理系统——01——研究背景单细胞质谱检测技术为单细胞化学特性分析提供了一种强有力的免标记分析手段，并在癌症分析、药物刺激、免疫分析等临床应用中展现出潜在价值。然而单细胞质谱往往需要进行必要的预处理操作，如将目标细胞从混合细胞群体样本中分离出来以提高质谱检测的准确性；除盐操作去除细胞常见缓冲液中的非挥发性盐，降低基质效应提高质谱检测灵敏度。目前这些预处理往往是通过多种设备或手动操作完成，效率较低；开发有效的一步式预处理方法对于单细胞质谱分析意义重大，但目前这方面的研究较为缺乏。为此，清华大学的王文会教授团队提出一种基于阻抗流式细胞术IFC的“一步式”分选除盐质谱预处理系统，经过处理的细胞样本可直接兼容现有的免标记质谱流式、液滴微萃取等单细胞质谱分析手段。研究工作以“Microfluidic Impedance Cytometry Enabled One-Step Sample Preparation for Efficient Single Cell Mass Spectrometry”为题发表在期刊Small上，并被选为Frontispiece。本工作基于IFC原理设计微流控芯片结构，结合压电驱动实现一步式单细胞分选除盐操作，将目标细胞从细胞群中分离出来的同时实现其外基质的置换。经实验验证，系统的分选效率99%、除盐效率99%，并被证实了在癌细胞和血细胞的分离、癌变细胞与正常细胞的分离与质谱检测方面的功能。图1. 基于阻抗流式细胞术的“一步式”分选除盐质谱预处理系统示意图——02——研究内容本工作中搭建了具有四层结构的微流控芯片，如图1所示。利用IFC进行细胞的电学及尺寸特性表征实现不同细胞的识别，待其流经分选区域时由压电执行单元对目标细胞进行分选，通过合适的流速配比，执行单元将目标细胞推至作为下鞘液的质谱兼容的挥发性盐溶液中，同时实现样本的分选与除盐。芯片采用两套电极，其中第1套用于单细胞电学表征，第2套用于表征确认除盐效率。图2. 微流控芯片结构及其工作流程示意图以商用均一性较好的6 μm和10 μm直径的PS微球对系统的分选效率进行了表征。在约9000个样本的实验中，系统展现出了99.53%的分选成功率，同时样本中的10 μm微球纯度由2.48%提升至92.23%，实现了约37倍的富集效率，如图3所示。此外在模拟血液中CTCs分离的实验中，在HeLa癌细胞与人体外周血单核细胞PBMC的混合样本中分选出HeLa细胞，其纯度由15.78% 提升至87.34%，展示出巨大的临床应用潜能。图3. 微流控系统的分选性能评估从定量的角度，以270 mM NaCl溶液作为样本液、去离子水作为下鞘液为例验证了系统的除盐效率，单次分选操作引入的NaCl物质的量仅为0.77±0.16 pMol，即使在300 cells/s的分选通量下除盐效率也能够达到99.62%；同时在实际的细胞样本测试中可以看出，未经除盐的样本信号被完全淹没，而经过该系统除盐后的能够清晰分辨单细胞的典型代谢与脂质峰，证实了系统优秀的除盐性能。图4. 微流控系统的除盐性能评估该系统进一步用于正常乳腺上皮细胞MCF-10A和癌变的乳腺癌细胞MDA-MB-468的分选与检测。通过双频点的锁相检测，分别表征了两类细胞的电学特性，并据此进行了分选操作，结果表明MCF-10A细胞的纯度由 10.64% 提升至77.78%，展现出了约7.31 倍的富集效率。此外将收集到的细胞样本直接与免标记质谱流式装置级联实验，同时表征了两类细胞的代谢特征，结果表明，部分显著差异表达的代谢和脂质可能是致使细胞电学特性差异的原因，充分验证了系统在多模表征与临床分析中的应用价值。图5. 正常细胞与癌变细胞的电学与代谢特性表征分析——03——总结展望本工作提出的基于IFC的一步法单细胞样品质谱预处理方法极大地方便单细胞质谱分析，突破了复杂操作和不必要的损耗。作为一个独立的样品制备模块，本微流控系统能够兼容多种质谱分析方法，为高效的质谱样品制备提供新的范式，进而为单细胞的多模态(如电学特性、代谢特征)表征提供新的思路。论文信息Microfluidic Impedance Cytometry Enabled One-Step Sample Preparation for Efficient Single-Cell Mass Spectrometry ；Junwen Zhu, Siyuan Pan, Huichao Chai, Peng Zhao, Yongxiang Feng, Zhen Cheng, Sichun Zhang, Wenhui Wang* (王文会，清华大学)；Small, 2024, https://doi.org/10.1002/smll.202310700作者简介本工作的完成单位为清华大学精密仪器系、精密测试技术与仪器全国重点实验室。精仪系王文会教授为通讯作者，精仪系博士研究生朱焌文为第一作者。清华大学张四纯教授、程振助理研究员、清华大学博士生潘思远、柴惠超、赵鹏、丰泳翔为论文工作做出了重要贡献。本研究得到了国家自然科学基金的资助。【相关阅读】有望提高2个数量级微流控介电泳分离通量！清华大学王文会Advanced Materials封面成果速递https://www.instrument.com.cn/news/20240604/722338.shtml 3i流式KOL|清华大学王文会教授团队在阻抗流式细胞术上取得系列进展https://www.instrument.com.cn/news/20231030/689623.shtml