生物糖蛋白质检测

糖是组成生命体的四大类重要分子之一，糖蛋白质是由糖链与肽链中的特定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质。糖蛋白质普遍存在于生物体内，在很多生命过程中起着重要作用，如蛋白质的折叠、细胞之间的相互识别、炎症反应等。同时，糖基化修饰在疾病中，特别是肿瘤的发生、发展和转移过程中也起到重要作用，许多疾病诊断标志物及治疗的靶标都是糖蛋白质。糖蛋白质组学和糖组学的研究具有重要的科学意义。以基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)为代表的生物质谱技术，因具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点，已成为糖蛋白质组和糖组分析的重要工具。　　由复旦大学杨芃原教授团队撰写的综述文章“质谱技术在糖蛋白质组学与糖组学方面的研究进展”发表于2016年第3期的《国家科学评论》。这篇综述论文系统介绍了近年来以质谱为核心的糖蛋白质组和糖组的研究策略和方法，以及该领域重要的生物和临床发现。重点讨论了国内糖蛋白质组学和糖组学研究团队在糖蛋白质和糖链的分离富集、糖链的衍生，糖链和糖蛋白质的质谱碎裂技术，糖链及糖蛋白质序列组成分析的软件技术等方面的进展，并分析了基于质谱技术的糖蛋白质组和糖组研究的关键问题，展望了该领域未来的发展趋势。　　杨芃原教授团队在基于质谱的糖蛋白质组学和糖组学方面展开了系统的研究。他们发展了一系列糖蛋白质/糖链富集和质谱定性的新方法，建立了基于复合纳米材料的富集新方法，基于新的共价反应的富集新策略，以及基于协同富集思路的富集新流程 建立了一系列糖蛋白质/糖链的质谱定量新方法，提出了酶促去糖链过程中的标记定量新方法和糖蛋白质组在蛋白质水平、糖基化程度水平及糖链水平的同时定量新方法等 开发了高通量糖蛋白质质谱检索的新算法等。这些工作提升了中国糖蛋白质组学和糖组学的研究水平，为糖蛋白质组学和糖组学研究提供了新的研究方法。

p 　　作为一名生长在齐鲁大地、深受儒家文化熏陶的青年学者，即便在海外求学多年，孙士生始终心系国家、情牵母校。伴随着时代的召唤，入选国家“千人计划”青年项目的孙士生毅然回到母校西北大学，希冀将他在美国掌握与研发的先进技术应用到西北这片广袤的大地上，以期为母校、为西北地区乃至为整个中国的科研水平真正实现与世界一流接轨尽一份力。 br/ /p p 　　“在我看来，在西部地区开展工作有一定的好处及空间，这里受到的外界诱惑和干扰应该会相对少一些，这份安静其实对于基础科学研究颇有助益。”对于未来，“我将继续在自己擅长的方向——糖蛋白质组学和生物标志物发现研究领域开展前沿研究”，为破译人类癌症的密码贡献力量。在接受《中国科学报》记者采访时，孙士生这样表示到。 /p p 　　和糖蛋白的缘分 /p p 　　2005年本科毕业后，孙士生进入西北大学攻读研究生，并在那里获得了硕士和博士学位。 /p p 　　“还在读大学的时候，我就对糖蛋白比较感兴趣。这个领域研究的人还比较少，但其实相当重要。当时教科书上关于糖蛋白的介绍还非常有限，从那时起我就开始注意搜集这方面的资料，没想到有一天还真的从事了这方面的研究。”孙士生回忆说。 /p p 　　糖蛋白是被聚糖共价修饰的一类蛋白质，糖蛋白上的寡糖链与肽链中的特定氨基酸残基侧链以糖苷键共价连接.糖蛋白普遍存在于动物、植物，真核微生物和各种病毒表面，种类繁多，功能广泛。其中N-连接的糖链合成起始于内质网，完成于高尔基体。其整个合成和分解过程受到各种酶类的特异催化和精确调控。其主要生物学功能为细胞或分子的生物识别，如人类ABO血型和精卵结合过程 另外，受体蛋白、肿瘤细胞表面抗原等亦均属糖蛋白。 /p p 　　近年来，科学界逐渐认识到，糖蛋白与很多疾病如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病、糖尿病以及某些遗传性疾病等的发生、发展有关。再者，细胞表面的糖蛋白及糖脂可“脱落”到周围环境或进入血循环，它们可以作为相关组织或细胞异常的标志为临床诊断提供信息 患某些疾病时体液中的糖蛋白亦常有特异性或强或弱的改变,这些糖蛋白的发现和应用将有助于疾病诊断或预后的判断。 /p p 　　读研伊始，孙士生从事的是生物芯片方面的研究，“后来因为参与一个糖芯片检测流感病毒宿主范围的项目，我有幸进入了糖蛋白的研究领域，或许这就是缘分吧”，孙士生说。 /p p 　　2011年，从西北大学毕业后，孙士生选择前往美国约翰· 霍普金斯大学Dr. Hui Zhang实验室做博士后，继续从事糖蛋白质组的方法学和生物标志物发现研究。 /p p 　　Dr. Zhang建立了经典分析糖蛋白方法，这在世界上属于蛋白质组学领域的权威。他所领导的实验室，有着很多国际前沿的技术和研究。有幸在这样的实验室工作，孙士生深觉受益匪浅。 /p p 　　“在国外，感触比较深的一点是，国外做科研，比较强调原创性。在美国，张老师会说，这个领域已经有人在做，而且做得不错，我们应该选择一些新的领域去探索。很多学者认为别人没做过的研究会更困难，其实不然，正是因为没人做过，发挥的空间才会更大”。 /p p 　　糖蛋白组学意义重大 /p p 　　在美多年，孙士生所做的诸多研究也产生了不小的国际影响力。 /p p 　　孙士生介绍说，随着蛋白质组学研究的日益成熟和规模化，蛋白翻译后修饰谱成为了新的研究焦点。蛋白糖基化修饰作为最重要、最普遍的蛋白质翻译后修饰之一，主要参与细胞间识别、调控、信号传导、免疫应答、细胞转化和疾病的发生发展。而系统高通量的糖蛋白质组研究方法是蛋白糖基化分析的基础。在美期间，他在Dr. Zhang建立的经典分析糖蛋白方法基础上，通过改变分析策略，创建了一种全面系统分析N-糖蛋白质组的新方法。该方法可广泛应用于肿瘤标记物筛查，蛋白抗体、病毒以及其他各种生物样品中的蛋白糖基化分析。同时，孙士生还建立了一些其他基于质谱分析的糖蛋白质组学新方法。 /p p 　　在蛋白质组/糖蛋白质组学在疾病生物标记物和致病机理研究中的应用方面，孙士生也取得了一定的进展。他与合作者将蛋白质组/糖蛋白质组相关方法学成功应用于各种临床样本分析中。其应用范围包括：人流感病毒、艾滋病病毒(HIV)及其感染的细胞和宿主，不同年龄和性别的人唾液，肝癌细胞系和HCC病人血清，前列腺癌细胞系、组织和血清，卵巢癌细胞系和组织、肺癌细胞系模型和肾衰竭动物模型。 /p p 　　“其中值得一提的是，我在博士后期间作为样本制备主要负责人之一参与了美国临床蛋白质组肿瘤分析(CPTAC)项目。我所在的实验室是全美参与此项目的五个核心实验室之一。在此项目中,我一直负责实验室内样品分析方法的建立，标准流程的制定，样品制备，质量监控和问题解决。目前已顺利完成本轮所有临床样本的蛋白质组和糖蛋白质组图谱的解析,其中蛋白质组的研究成果已在Cell杂志发表”，孙士生说。 /p p 　　回国的“青年千人” /p p 　　梁园虽好，终非故土。在美国学习和工作多年后，孙士生最终选择回到西北大学，并在2017年顺利获得了中组部 “千人计划”青年项目的资助。 /p p 　　“我选择回西北大学，很大程度上是出于对母校的热爱。这儿有我老师、同学和朋友的帮助和支持。有着悠久历史的西北大学近年来综合实力也在蒸蒸日上”，孙士生指出，西北大学学术氛围相对自由，对青年学者没有设置太多限制，“选择西北大学，也有这方面的考量。” /p p 　　回到母校后，孙士生希望能将本人所学，特别是他在糖蛋白质组学及新的肿瘤标志物发现等领域所积累的研究经验及学术成果服务于祖国，同时将母校建设的更好。 /p p 　　展望未来，孙士生表示，他将继续致力于糖蛋白质组学新技术的开发并将其应用于新的生物标志物发现、致病机制研究和蛋白糖基化调控机制研究中。他已针对这些设想制定了详细的工作计划。 /p p 　　孙士生表示，蛋白质组研究技术在癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面具有诱人的应用前景。糖类作为重要的生物大分子之一，参与各种重要的生物学过程。然而系统糖生物学研究包括系统的糖链解析、高通量的糖蛋白和糖脂分析等才刚刚起步：“在中国从事这方面的研究，必然会大有可为。” /p p br/ /p

p 　　复旦大学化学系教授杨芃原团队、中科院计算技术研究所研究员贺思敏团队、国家蛋白质科学中心(上海)研究员黄超兰团队合作研究，创建了基于质谱的高通量糖基化肽段分析方法pGlyco2.0，为精准N糖蛋白质组学提供了新技术。今天，相关研究成果以《pGlyco2.0：基于综合质控和一步质谱法的精准N糖蛋白质组学糖肽分析方法》为题发表于《自然· 通讯》。 /p p 　　据悉，杨芃原、贺思敏和黄超兰为共同通讯作者。杨芃原为该文的Lead Contact。 /p p 　　糖基化是最复杂的蛋白后修饰之一。与其他蛋白后修饰相比，糖基化不但会产生宏观不均一性(每个蛋白上可能有多个后修饰位点)，更会产生海量的微观不均一性(每个位点上可能有几十甚至上百种不同的后修饰基团)。此外，糖链本身的离子化效率很低。这些因素的结合使得糖基化分析的通量和质量远低于蛋白质组学的常规分析水平。 /p p 　　这项研究通过深入研究和测试质谱条件，开发基于阶梯能量的一步质谱采集法，提高了糖肽鉴定的通量和开发具有自主产权的pGlyco2.0糖肽检索引擎，从糖链、肽段、糖肽三个层面对糖肽数据库检索进行精确质控，从而大幅提升了N糖蛋白质组学分析的通量和质量。 /p p 　　同时，研究人员首次将重标元素应用于糖肽鉴定准确度分析，为该领域的质控分析提供了新的方法及标准。 /p p 　　专家表示，这项研究报道了目前最大的糖基化数据集：在1%的假阳性率下，在小鼠的五个脏器种鉴定到了超过一万条N糖肽。 /p p /p