冬氨酸钙

近期，中科院合肥研究院智能所黄青研究员课题组利用红外和拉曼光谱识别赖氨酸乙酰化特征，为生物系统中蛋白质乙酰化结构分析提供了理论和实验基础。相关研究成果发表在国际光谱专业期刊Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy上。 乙酰化是生物学中常见且极其重要的蛋白质修饰，在细胞代谢中都起着关键性的调节作用。蛋白质乙酰化有两种方式，一是赖氨酸残基特有的乙酰化，二是多种氨基酸残基都可发生的N-末端乙酰化。目前一般用N-末端乙酰转移酶来标记判断赖氨酸残基是否发生乙酰化，但该方法的准确性仍存在争议。在分子水平识别蛋白质乙酰化是目前研究挑战之一，其关键是对赖氨酸的乙酰化进行准确定位表征，由此获得清晰和系统的认识。 针对这种情况，研究团队通过红外和拉曼光谱实验以及密度函数理论(DFT)计算，系统地研究L-赖氨酸三种乙酰化类型(、和)的结构变化及相应的振动光谱特征，发现酰胺基、羧基等基团的红外和拉曼特征谱带能用于有效识别不同的乙酰化类型。换言之，从红外和拉曼光谱特征即可判断赖氨酸是否乙酰化，也可判断赖氨酸发生了 乙酰化，还是 乙酰化，或者同时乙酰化。同时，研究团队对乙酰化的振动光谱识别策略在多肽模型中也得到验证。基于此，该项研究工作提供乙酰化赖氨酸的振动模式解析，并提出赖氨酸乙酰化的光谱识别和新的表征方法，为生物系统中蛋白质乙酰化结构分析提供了理论和实验基础。 　　该研究工作得到了国家自然科学基金和安徽省自然科学基金的资助。赖氨酸和三种乙酰化赖氨酸的分子结构Lys-G4多肽及其赖氨酸残基乙酰化的理论计算红外光谱(红色为乙酰基，蓝色为乙酰基)

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal Chem.上的文章，Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry [1]。该文章的通讯作者是来自马萨诸塞大学阿默斯特分校的Richard W. Vachet教授。组氨酸是人体蛋白质结构中的重要组成氨基酸，研究发现，组氨酸具有Nδ-H和Nε-H两种互变异构体，通过两种互变异构体的转换，可以在蛋白质中介导质子转移。目前常使用2D NMR技术进行区分，但操作相对繁复。共价标记质谱是一种研究蛋白质结构的有力方法，具有操作简单，灵敏度高，结构分辨率高等优点。在本文中，作者尝试以焦碳酸二乙酯（DEPC）为标记试剂，采用共价标记质谱区分组氨酸互变异构体。组氨酸侧链的咪唑上具有两个氮原子，其中一个氮上的孤电子对参与芳香环π键的组成，而另一个氮原子仍保留孤对电子，更容易与DEPC等亲电子试剂反应。而组氨酸的两个互变异构体中都只有一个保留孤对电子的氮原子，且该氮原子位置不同，Nδ-H互变异构体中的Nε2与DEPC反应，而Nε-H互变异构体中的为Nδ1。因此以DEPC标记组氨酸以区分两个互变异构体的方法是可行的（图1）。图1. DEPC 结构及其与两种不同组氨酸互变异构体的反应 为了测试DEPC 标记区分两种互变异构体的能力，作者以几种含组氨酸的肽，在确保DEPC仅标记组氨酸条件下进行实验。以Fmoc-DGHGG-NH2为例子，该肽在N端包括一个Fmoc基团以确保仅标记组氨酸。采用等度洗脱来最大限度地利用LC分离两种异构体，并确保流动相组成不影响肽段电离效率，从而可以更好地量化每个互变异构体的比率。结果发现，在11.4和13.6分钟洗脱的峰具有相同的m/z值（图2）。根据串联MS数据，发现这两个峰代表着组氨酸上成功标记DEPC的单一物质（图3）。并且，这些同量异位离子的串联质谱不同，表明这两种物质为带有不同组氨酸互变异构体的物质。作者将先洗脱出的物质命名为修饰物质1，后洗脱出的为修饰物质2。根据MS/MS数据，两者的主要区别为修饰物质2具有更加丰富的羧基化a3离子（a3*）。图2. 未标记（蓝色迹线）和 DEPC 标记（红色迹线）肽 Fmoc-DGHGG-NH 2的提取离子色谱图。DEPC浓度比肽浓度高10倍，反应1分钟图3. 两种修饰的His异构体的串联质谱。(a)来自图2中的色谱图的修饰物质 1 的串联质谱。(b)来自图2中的色谱图的修饰物质2的串联质谱。标有星号 (*) 的产物离子包含羧基化产物此外，在重复实验中，作者发现物质2与物质1的丰度比为3.9± 0.2。而研究发现，在中性pH条件下，游离氨基酸Nε-H 互变异构体与 Nδ-H 互变异构体的比接近于4:1。因此，两物质的峰面积比表明物质1可能为 Nδ-H 互变异构体，而物质2可能为 Nε-H 互变异构体。结合以上发现，并考虑肽解离途径等因素，作者对两物质质谱图谱差异做出推测。当物质2为Nε-H互变异构体侧链时，DEPC 标记在Nδ1上，有利于肽通过bx-yz途径解离，随后通过bx-ax途径损失CO，因此物质2富含a3*离子。当物质1为Nδ-H 互变异构体时，DEPC 标记在Nε2上，肽通过组氨酸途径解离，并形成了稳定五元环，因此优先形成更稳定的b3*离子（图4）。以上发现进一步证明了Fmoc-DGHGG-NH2中物质1为 Nδ-H 互变异构体，物质2为 Nε-H 互变异构体。根据丰度比以及肽解离途径不同，作者在其他模型肽标记实验中也成功区分两互变异构体。由于组氨酸的pKa在一定程度上会影响互变异构体的比例，因此两互变异构体的丰度比可能会略有变化。总之，以上结果表明，DEPC共价标记质谱可以识别两个组氨酸互变异构体。图4. DEPC 标记的含组氨酸肽 CID 过程中两种异构体的肽片段化途径。左侧通路为物质1（Nδ-H互变异构体），右侧通路为物质2（Nε-H互变异构体）之后，作者还进一步研究了不同DEPC浓度对实验的影响。结果发现，在 DEPC 浓度范围超过一个数量级时，Fmoc-DGHGG-NH2的两种修饰形式的比率基本在4左右保持恒定，其他模型肽的比率略有不同（图5），但随着 DEPC 浓度的增加，给定肽的标记比率保持不变。在质谱可以确认互变异构体结构的肽中，Nε-H互变异构体总是丰度相对更高，洗脱相对较晚。此外，作者发现当组氨酸不是位于N末端残基时，Nε-H 互变异构体的an */bn *比率总是比Nδ -H 互变异构体的更高。但是，若组氨酸残基位于肽的N末端时，在质谱中观察不到b1和a1离子，将对结果造成影响。图 5. 在 DEPC 浓度增加时选择肽的两种修饰形式的标记比率。(a) Fmoc-DGHGG-NH2；(b) Ac-IQVYSRHPAENGK(Ac)；(c) Ac-VEADIAGHGQEVLIR；(d) Ac-LFTGHPETLEK(Ac)。MS/MS 用于通过测量an /bn离子的比率来确认每个互变异构体总而言之，作者成功使用DEPC共价标记质谱区分肽与蛋白质中的组氨酸互变异构体，利用丰度比与洗脱时间，以及CID期间的肽解离模式，区分两种互变异构体。利用该方法，作者团队已经确定了几种蛋白质组氨酸互变异构体比率，并且相对于2D NMR方法，该方法更简单、更快、更精确，有利于探索蛋白质中组氨酸残基周围的局部结构，提供高分辨率的结构信息。[1]Pan X, Kirsch ZJ, Vachet RW. Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 Jan 18 94(2):1003-1010.

瓜氨酸化是影响蛋白质结构和功能的关键的翻译后修饰。尽管它与各种生物过程和疾病发病紧密相关，但由于缺乏有效的方法来富集、检测和定位该翻译后修饰，其潜在机制仍然知之甚少。近期，威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组报道了生物素硫醇标签的设计和开发，该标签能够通过质谱法对瓜氨酸化进行衍生化、富集来实现可靠的鉴定。作者对小鼠组织的瓜氨酸化蛋白质组进行了全局分析并且从432种瓜氨酸化蛋白质中识别出691个修饰位点，这是迄今为止最大的瓜氨酸化数据集。作者发现并阐述了这个翻译后修饰的新的分布和功能并且表示该方法有希望为进一步破译瓜氨酸化的生理和病理作用奠定基础。这项工作以“Enabling Global Analysis Of Protein Citrullination Via Biotin Thiol Tag-Assisted Mass Spectrometry”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03844)，文章作者为Yatao Shi#, Zihui Li#, Bin Wang#，Xudong Shi , Hui Ye, Daniel G. Delafield, Langlang Lv, Zhengqing Ye, Zhengwei Chen, Fengfei Ma，Lingjun Li*。此外，李灵军教授课题组进一步拓展了此方法的实用性。作者通过应用二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。相关成果以“12-Plex DiLeu Isobaric Labeling Enabled High-Throughput Investigation of Citrullination Alterations in the DNA Damage Response”为题同样发表在Analytical Chemistry上(https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04073)，文章作者为Zihui Li, Bin Wang, Qinying Yu, Yatao Shi, Lingjun Li*。　　研究的主要内容　　作者设计了一种生物素硫醇标签，它可以很容易的以低成本合成并且可以与瓜氨酸残基和2,3-丁二酮发生特异性反应(图 1a)。这种衍生化不仅增加了质量转移以允许更可靠的鉴定，而且还引入了生物素部分，使修饰分子的后续富集成为可能。该生物素硫醇标签设计具有紧凑的结构，在高能碰撞解离 (HCD) 期间仅产生两个碎片/诊断离子(图 1b)。 因此，肽主链可以保持良好的裂解效率，并在 HCD 或电子转移解离 (ETD) 期间分别产生丰富的b/y或c/z离子系列。在 HCD(图 1c)、ETD或电子转移/高能碰撞解离(EThcD)碎裂下，衍生化肽标准品的序列收集质谱图几乎完全覆盖相应的肽序列。实验结果表明生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽可以产生用于解析及标注的高质量的串联质谱图，并且与各种裂解技术相结合时可以提高瓜氨酸化位点的识别可信度。　　图1|用于瓜氨酸化分析的生物素硫醇标签设计。a，使用生物素硫醇标签和 2,3-丁二酮对瓜氨酸肽进行衍生化。 b，HCD、ETD 或 EThcD 片段化后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽的片段化位点。c，HCD裂解后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸肽标准品 SAVRACitSSVPGVR 的串联质谱图。　　在接下来的实验中作者使用该生物素硫醇标签和基于质谱的自下而上的蛋白质组学方法对瓜氨酸化进行分析(图2a)。作者在体外利用 PAD(一种可以催化瓜氨酸化的酶)催化的人组蛋白 H3 蛋白来验证这个过程。作为未被PAD催化的阴性对照，未发现组蛋白的肽段被鉴定为瓜氨酸化，证明了生物素标签反应的高特异性(图 2b)。在体外 PAD 处理后，作者 发现许多精氨酸残基被催化为瓜氨酸，并且大量的位点被高可信度的鉴定为瓜氨酸化位点(图 2c)，进一步表明该方法的高效性。在 HCD 碎裂后，其产生了一系列丰富的 b/y 离子，可以帮助准确的表征在同一肽段上单个(图 2d)以及多个(图 2e)瓜氨酸化位点。　　图2|使用生物素硫醇标签进行体外瓜氨酸化分析。a，使用生物素硫醇标签进行蛋白质瓜氨酸化分析的实验工作流程。b、c，在体外 PAD 处理之前 (b) 和之后 (c) 组蛋白 H3 蛋白的瓜氨酸化分析。 已识别的瓜氨酸化位点在序列中以蓝色字母突出显示。 序列下方的红色矩形表示鉴定的瓜氨酸化肽，而瓜氨酸化位点以蓝色显示。 d，PAD处理的组蛋白 H3 (R64Cit) 的已鉴定瓜氨酸化肽的串联质谱图示例。 e，PAD 处理的组蛋白 H3 的同一肽上鉴定的两个瓜氨酸化位点(R70Cit 和 R73Cit)的串联质谱图示例。　　接下来，作者们尝试利用所开发的方法对复杂的生物样本中的瓜氨酸化进行全局分析，并希望能够以此提供阐明生物体中瓜氨酸化调节机制的依据。首先，作者对小鼠的六个身体器官和五个大脑区域进行了深入的瓜氨酸组分析，生成了第一个小鼠瓜氨酸组组织特异性数据库。作者从432种瓜氨酸化蛋白质中以高置信度的方式鉴定了691个瓜氨酸化位点(图 3a)。更重要的是，这些蛋白质中约有 60% 未曾在UniProt 数据库检索并被报道，这一结果极大地扩展了对瓜氨酸化以及这些底物蛋白质如何受到瓜氨酸化影响的理解。作者发现结果中与 UniProt 数据库的已知的瓜氨酸位点重叠部分较少(图 3b)，这可能是因为 UniProt 中描述的近 40% 的瓜氨酸化位点是基于相似性外推理论而没有实际的实验证据。此外，许多报道的位点位于组蛋白上，尤其是蛋白质末端，可能会逃过自下而上质谱策略的检测(图 3b)。图 3c 展示了单位点瓜氨酸化和多位点瓜氨酸化蛋白质分布情况，其中 70% 的已鉴定蛋白质仅有一个瓜氨酸化位点被检测到。　　这个新发现的瓜氨酸化蛋白质组为推测瓜氨酸化的调控机制提供了宝贵的资源。例如，作者在髓鞘碱性蛋白(MBP)上鉴定到了九个瓜氨酸化位点，而在 UniProt 数据库中只有四个(图3d)。作者的结果提供了高质量的串联质谱图，不仅证实了已知修饰位点的存在(图3e)，而且还高可信度的识别了未知的位点(图 3f)。然后作者进行了瓜氨酸化肽段的序列分析，发现在鉴定的瓜氨酸化位点两侧并没有高度保守的氨基酸序列模式(图3g)，但是谷氨酸残基更频繁地出现在瓜氨酸的N末端侧附近。这与Fert-Bober 等人报道的小鼠瓜氨酸组分析结论一致。另一方面，Tanikawa 等人发现在人体组织和血浆中大约五分之一的 PAD4 底物含有 RG/RGG 基序。同样，Lee 等人及相关研究人员观察到天冬氨酸和甘氨酸残基在瓜氨酸化位点出现频率偏高。值得注意的是，这些研究使用了不同的人源细胞系或组织，因此作者的结果可能表明在不同物种之间瓜氨酸化位点周围的序列模式是不同的。为了更好地辨别瓜氨酸化蛋白质所涉及的功能，作者展示了基因本体论(GO)富集分析的热图，其显示了二十个最显著富集的细胞成分(图3h)以及KEGG途径(图3i)。作者发现小鼠大脑组织和身体器官之间存在明显差异，而瓜氨酸蛋白更多地参与大脑功能。具体来说瓜氨酸化蛋白质集中在轴突、髓鞘、核周体和突触中，因此在中枢神经系统中可能发挥着重要的作用。　　图3|不同小鼠组织的大规模瓜氨酸组分析。a，不同小鼠组织中已鉴定的瓜氨酸化蛋白和瓜氨酸化位点的数量。 b，本研究中鉴定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中报告的位点比较。 c，每个鉴定的瓜氨酸化蛋白质的瓜氨酸化位点数量分布。d，本研究中确定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中关于髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化位点的比较。e、f，在髓磷脂碱性蛋白 R157Cit (e) 和 R228Cit (f) 上鉴定的两个瓜氨酸化位点的示例串联质谱图。g，鉴定的瓜氨酸化肽的序列。瓜氨酸化位点位于中间的“0”位置。字母的高度表示每个氨基酸在特定位置的相对频率。 h,i，使用 Metascape 生成的热图显示不同小鼠组织中显着丰富的(p 值 0.01)细胞成分 (h) (KEGG) 通路 (i)。　　为了进一步拓展该方法的实用性，作者应用了二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略，第一次实现了对瓜氨酸化进行高通量的定量研究。作者首先使用瓜氨酸化标准肽段进行测试，证明在优化反应条件下DiLeu标记和生物素硫醇标记反应可以分步进行而不互相干扰(图 4B，4C)。同时，将标准肽段按照已知比例进行4-plex DiLeu标记并混合，再进行生物素硫醇标记和瓜氨酸化分析，结果显示了非常好的定量准确性(图5)。作者进一步优化了运用该方法在复杂生物样品中进行定量分析的实验方法，并且证明此方法依然可以实现极佳的定量准确度和精确度(图6)。　　图4|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记分步反应的特异性和效率　　图5|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确性　　图6|复杂生物样品测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确度和精确度　　作者接下来应用该方法对DNA损伤中瓜氨酸化的作用进行了研究。作者在MCF7细胞中用三种方法造成了DNA损伤，并定量分析了蛋白质瓜氨酸化的变化。作者一共鉴定到63种瓜氨酸化蛋白以及其包含的78个瓜氨酸化位点，并发现三个实验组中的瓜氨酸化表达相比于对照组呈现出非常不同的趋势(图7A)，这一结果表明瓜氨酸化在不同类型的DNA损伤模型中具有差异性的作用。通过对实验组中显著变化的瓜氨酸化蛋白进行生物过程网络分析，作者发现瓜氨酸化主要对DNA代谢，蛋白结构变化，翻译以及DNA修复等过程进行调控(图 7B，7C)。该实验结果表明蛋白瓜氨酸化对DNA损伤以及相关发病机理具有非常重要的作用。　　图7|高通量定量分析研究瓜氨酸化在DNA损伤中的变化及作用(来源：Anal. Chem.)　　小结　　本文章介绍了一种生物素硫醇标签的设计和开发，该标签可与瓜氨酸化肽段发生特异性反应并极大地提高了瓜氨酸化的富集和检测效率。在使用标准肽和重组蛋白证明该方法的有效性后，作者进一步优化了从复杂生物样品中检测瓜氨酸化的实验过程。通过此方法对小鼠五个大脑区域和六个身体器官的蛋白质瓜氨酸化进行分析，作者鉴定出432个瓜氨酸化蛋白以及691个瓜氨酸化位点，这是迄今为止最大的数据集。该研究揭示了这种翻译后修饰可能在神经系统中发挥的关键作用，并表明它们在包括呼吸和糖酵解在内的许多代谢过程中也可能发挥着重要作用。总的来说，实验结果表明蛋白质瓜氨酸化在不同组织中具有广泛分布并参与各种生物过程，这扩展了目前对蛋白质瓜氨酸化生理作用的认知和理解。此外，作者进一步拓展了此方法的实用性，通过应用DiLeu等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。更重要的是，该方法可以提供一种普适、简单而强大的检测方法来明确鉴定蛋白质瓜氨酸化，这也将启发和有益于未来对这种翻译后修饰在生理和病理条件下的功能作用的研究。　　相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry上的两篇文章中, 通过生物素硫醇标签辅助质谱法对蛋白质瓜氨酸化进行全局分析文章的共同第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生石亚涛，李子辉，王斌，并与中国药科大学叶慧教授课题组合作 应用二甲基化亮氨酸等重标记策略进行蛋白质瓜氨酸化高通量定量研究文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生李子辉，两篇文章通讯作者为李灵军教授。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/